?細(xì)胞滾動(dòng)粘附實(shí)驗(yàn)--間充質(zhì)干細(xì)胞在膠原蛋白I表面的血栓沉積研究
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間充質(zhì)干細(xì)胞在急性或慢性心肌缺血的研究中展示出其是一個(gè)非常理想的細(xì)胞治療候選。但是，間充質(zhì)干細(xì)胞在作為冠狀動(dòng)脈注射細(xì)胞治療時(shí)的安全性還有待評(píng)估。一個(gè)理想的方法是使用病人自身的干細(xì)胞進(jìn)行增殖后用于治療。愛爾蘭的科研人員針對間充質(zhì)干細(xì)胞對于細(xì)胞治療的安全性進(jìn)行了研究。其主要針對于間充質(zhì)干細(xì)胞天生的血栓前特性和在心肌梗塞后向冠狀動(dòng)脈遷徙治療的安全性進(jìn)行了研究。 其中，研究人員進(jìn)行了了流動(dòng)狀態(tài)下血栓集結(jié)在膠原蛋白上的實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，研究人員還用熒光底物測定的實(shí)驗(yàn)來研究間充質(zhì)干細(xì)胞在無血小板血漿中的凝血酶的產(chǎn)生情況。
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研究人員在做血栓沉積實(shí)驗(yàn)時(shí)使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)，將膠原蛋白I鋪在道載玻片上觀測間充質(zhì)干細(xì)胞在10dyn/cm2的情況下的粘附情況。
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Stem Cells. 2015 Sep;33(9):2726-37. doi: 10.1002/stem.2050. Epub 2015 Jun 4.
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Have Innate Procoagulant Activity and Cause Microvascular Obstruction Following Intracoronary Delivery: Amelioration by Antithrombin Therapy.
Gleeson BM1, Martin K1, Ali MT1, Kumar AH1, Pillai MG1, Kumar SP1, O'Sullivan JF1, Whelan D1, Stocca A1, Khider W1, Barry FP2, O'Brien T2, Caplice NM1.
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一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備
1）細(xì)胞： 豬分離MSC細(xì)胞（mesenchymal stem cell）
??????????豬源FB細(xì)胞（fibroblast）
??????????豬源EC細(xì)胞（endothelial cell） ????????????????????????
2）培養(yǎng)基：Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification（α-MEM）
3）試劑： mouse anti-human TF （clone：HTF-1）
??????????IgG
??????????Collagen I
??????????Heparin
4）培養(yǎng)耗材：ibidi單通道載玻片μ-Slide I0.4?Luer （ibidi，Germany，80176）
?????????????灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）
?????????????96孔黑色免疫熒光板 （ ibidi， Germany，89626）
5）儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）
????????????????????????Wallac Victor fluorimeter
????????????????????????multicolour fluorescent microscopy （Nikon）
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二、實(shí)驗(yàn)方法
在實(shí)驗(yàn)開始前一天，請將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置過夜，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。
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一）細(xì)胞滾動(dòng)粘附實(shí)驗(yàn)：
1）載玻片包被：
① 將100μl 的 250μg/ml的膠原蛋白I型溶液，注入通道中。
② 室溫孵育60分鐘
③ 吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘，即可開始使用
2）準(zhǔn)備滾動(dòng)粘附實(shí)驗(yàn)
① 搭建流體系統(tǒng)，灌流管按照說明放在置在流體單元上，加入少量無細(xì)胞培養(yǎng)基，運(yùn)行去氣泡程序。
② 連接通道載玻片，將上述通道載玻片中加滿無細(xì)胞培養(yǎng)基，兩側(cè)注液孔中液體要是過滿狀態(tài)，之后再將灌流管和載玻片相連。
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圖四：a）封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b）將其中一個(gè)魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j）按圖示，將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連，注意不能產(chǎn)生氣泡，會(huì)有部分培養(yǎng)基溢出。k）連接好后，將封口夾移除，用無塵紙將溢出的培養(yǎng)基擦除。l）全部連接好。
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③ 檢查灌流系統(tǒng)是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門。將封口夾夾住其中一根硅膠管，如果兩邊的灌流儲(chǔ)液管液面不會(huì)下降或者上升，那么，整個(gè)系統(tǒng)就是密封的，并且是正確安裝的。
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3）開始滾動(dòng)粘附實(shí)驗(yàn)（單向?qū)恿鳎＿B接好載玻片的灌流管中加入用全血血漿重懸的間充質(zhì)干細(xì)胞。 再將流體單元與ibidi泵相連，以 10dyn/cm2的剪切力開始流體實(shí)驗(yàn)。用nikon顯微鏡采集圖像，每5分鐘拍攝一張照片。
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三）凝血酶的測定--熒光底物測定實(shí)驗(yàn)
1）去血小板血漿可以通過2500g離心15分鐘全血得到。
2）間充質(zhì)干細(xì)胞重懸在去血小板血漿中，以加入HTF-1和IgG為對比，用FB和EC作為對照。
3）加入thrombin generation assay（TGA）試劑，并且用ibidi 96孔板檢測凝血酶的濃度。
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三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
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一）滾動(dòng)粘附實(shí)驗(yàn)
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如圖所示，使用全血作為對照（WB），可以看到間充質(zhì)細(xì)胞有非常顯著的粘附行為，而加入肝素的間充質(zhì)細(xì)胞，粘附行為又有非常顯著的下降。
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二）凝血酶的測定
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如圖所示，以MSC溶血酶濃度加入α-TF比IgG要多得多。而MSC比FB也有非常顯著的差異。
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