簡介：免疫(共)沉淀(IP/Co-IP)是基于抗體和蛋白的特異性親和作用，通過捕獲與蛋白或抗原特異性結合的抗體，進而從復雜的樣品中捕獲及富集目標蛋白，同時可以測定與之相互作用的蛋白或其它生物大分子。

實驗前：

為了獲得更好的實驗結果，所有的步驟均需要根據實際情況進行優化。例如：根據細胞系或被捕獲的抗原后續用途的不同可選擇更加合適的細胞裂解條件。對于沒有細胞壁結構的哺乳動物細胞，可以直接使用去污劑進行裂解，但其它細胞，則需要一些機械剪切力輔助，例如超聲破碎。以下列出的（包括裂解液、孵育時間、體積及濃度）是作為初始嘗試的條件建議，最終的優化需要根據實際情況調整。

另外，細胞裂解物在進行免疫(共)沉淀前，可先進行蛋白免疫印跡法檢測，以此來確定細胞裂解物里存在目標蛋白。

A. 溶液和試劑

B. 制備細胞裂解物

1. 吸干培養基。添加含有調節分子的新鮮培養基，使其在預定的時間內對細胞進行處理。

2. 收集細胞，去除培養基后用冰預冷的 1X PBS 洗滌細胞一次。

3. 去除 PBS 并在每個細胞板上 (10 cm) 加入 0.5 ml 冰預冷的 Lysis buffer，并在冰上孵育至少 5 分鐘。

4. 從板上刮下細胞，把提取物轉移至微量離心管。置于冰上。

5. 在冰上進行 3 次超聲破碎，每次 5 秒。

6. 在 4°C，在 14,000 x g 條件下，微量離心 10 分鐘，將上清轉移到新管中。上清液即為細胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。 注：細胞裂解物制備好之后，可先進行蛋白免疫印跡法檢測，以此來確定細胞裂解物里存在目標蛋白。

C. 免疫沉淀法

細胞裂解物預清除（可選步驟）

1. 向500μl（含總蛋白200-1000ug） 細胞裂解物中添加 5μl Protein A和5μl Protein G。

2. 在 4°C 下，旋轉孵育30-60分鐘。 3. 4°C 條件下12000g離心1min，保留上清，待用。

抗原抗體結合

1. 在新的離心管內加入500μl（含總蛋白200-1000ug）細胞裂解物（可以是預清洗后的細胞裂解物）。

2. 加入目標蛋白的單克隆/多克隆抗體（1-5μg），

3. 同時采用非特異免疫的同源抗體作為對照。 4. 在4℃輕柔混合過夜。

免疫復合物沉淀

1. 抗體孵育過夜后，加入5μl Protein A和5μl Protein G。 2. 在4℃溫和地混勻1-3小時或過夜。

3. 12000g離心1min，保留沉淀。 4. 使用0.5ml 1*Wash buffer清洗沉淀，12000g離心1min，保留沉淀。

5. 重復第4步，共計清洗3次。

注：清洗，去上清的時候需要注意避免吸走填料

D. 用蛋白免疫印跡法進行分析

1. 在 20-40 μl 1* SDS 樣品緩沖液中重懸沉淀物。渦旋振蕩，然后再微量離心 30 秒。

2. 將樣品加熱至 95–100°C 并持續 2-5分鐘，然后在 14,000 x g 下瞬時離心 1 分鐘。

3. 將樣品 (15-30 μl) 上樣到 SDS-PAGE 凝膠上。

4. 用蛋白質印跡法分析樣品。

IP/Co-IP常見問題解析

◆Co-IP出現假陽性

考慮抗體特異性，使用特異性更高抗體；適當降低抗體濃度。

◆Co-IP實驗結果檢測到重鏈或輕鏈

用兔IgG作為對照，排除影響；用抗Fab和Fc抗體特異性封閉重鏈和輕鏈；選擇不識別重鏈和輕鏈二抗使用。

◆Co-IP未檢測到與目的蛋白相互作用的蛋白或信號太弱

裂解液中的去垢劑濃度太高或配方過于劇烈，降低去垢劑濃度或更換去垢劑種類；蛋白與蛋白之間的相互作用太弱或不太穩定，應選擇親和力更高的抗體以捕獲更多目的蛋白，從而捕獲更多的相互作用蛋白，過表達提高目的蛋白的含量，選擇目的蛋白或相互作用蛋白含量高的樣品進行免疫共沉淀實驗。

◆IP/Co-IP實驗失敗原因有哪些？

樣品被蛋白酶降解?？商砑拥鞍酌敢种苿?protease inhibitor)；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止凍融。

抗體濃度太低。調整使用抗體濃度， 必要時設立濃度梯度，摸索最佳濃度。抗體親合力太低。選用適合于實驗的相應抗體。IP抗體未與agarose珠子結合。選用適合于IP的相應珠子，正確保存防止變質或干燥。