?方法一：LDH釋放檢測
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a.根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養板中，使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。
b.吸去培養液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養液(推薦使用含1%血清的低血清培養液或適當的無血清培養液)，將各培養孔分成如下幾組：包括無細胞的培養液孔(背景空白對照孔)，未經藥物處理的對照細胞孔(樣品對照孔)，未經藥物處理的用于后續裂解的細胞孔(樣品最大酶活性對照孔)，以及藥物處理的細胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標記。按照實驗需要給予適當藥物處理如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設置不同濃度，不同處理時間，對照孔中需加入適當的藥物溶劑對照)，繼續按常規培養。到預定的檢測時間點前1小時，從細胞培養箱里取出細胞培養板，在“樣品最大酶活性對照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復吹打數次混勻，然后繼續在細胞培養箱中孵育。
c.到達預定時間后，將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進行樣品測定。
方法二：細胞內總LDH的檢測
a.細胞毒性檢測：根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養孔板中，使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。加入不同藥物進行處理，并設置適當對照。藥物刺激完畢后，將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻，適當搖晃培養板混勻，然后繼續在細胞培養箱中孵育1小時。隨后將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進行樣品測定。
b.細胞增殖檢測：根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養孔板中，使促進細胞增殖的藥物刺激后細胞不超過80-90%滿為宜。使用不同的藥物刺激細胞，并設置適當對照。藥物刺激完畢后，將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當搖晃混勻胞，然后繼續在細培養箱中孵育1小時。隨后將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進行樣品測定。
注：LDH釋放檢測更加常用一些，細胞內總LDH檢測通?？梢允褂肕TT、WST-1或CCK-8等方法替代。
2.?試劑盒的準備工作：
a.INT溶液(1X)的配制：根據所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT 稀釋液，混勻后即配制為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現配現用，配制后4℃保存可于當天使用，不宜配制后凍存。
b.LDH檢測工作液的配制: 根據待測定的樣品數(含對照)，參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工作液。
注意：LDH檢測工作液必須現配現用，配制和使用過程中均要注意適當避光。
| 檢測次數 | 1次 | 10次 | 20次 | 50次 |
| 乳酸溶液 | 20μl | 200μl | 400μl | 1ml |
| INT溶液(1X) | 20μl | 200μl | 400μl | 1ml |
| 酶溶液 | 20μl | 200μl | 400μl | 1ml |
| 總體積 | 60μl | 600μl | 1.2 ml | 3ml |
c.(選做)如果希望進行LDH酶活性的絕對定量，需自備LDH標準品，并新鮮配制不同濃度LDH標準品，如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、 0.65mU/ml、0 mU/ml。
3. 樣品測定:
a.各孔分別加入60μl LDH檢測工作液。
b.混勻，室溫(約25℃) 避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側擺搖床上緩慢搖動)。然后在490nm處測定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一 波長作為參考波長進行雙波長測定。
c.計算(測得的各組吸光度均應減去背景空白對照孔吸光度)
d.細胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對照孔吸光度) / (細胞最大酶活性的吸光度－樣品對照孔吸光度)×100
e.可繪制細胞毒性曲線：縱座標為實際吸光度，橫坐標為藥物濃度；據此可計算該藥物作用特定時間的半致死劑量LD50。
附錄1：
可同時測定一已知濃度的LDH酶標準品對應的吸光度值，參考以下公式粗略計算出樣品中LDH酶活力：
待測樣品中LDH活力單位(mU/ml)＝
(樣品孔吸光度－背景空白對照孔吸光度) / (標準管吸光度－標準空白管吸光度)×標準品濃度(mU/ml)；
根據計算結果可以比較不同樣品處理組間有無統計學差異等。
附錄2：
若需準確計算出LDH酶活性的絕對活性，可通過一系列LDH標準品及相應測得的吸光度值繪制標準曲線，通過標準曲線相應公式計算出樣品中LDH的酶活性。
各孔數值減去空白對照后，以檢測的吸光度(OD490)為縱坐標，LDH酶活力(mU)為橫坐標，繪制LDH標準曲線。同時計算出該趨勢線的公式。
A490nm＝k×LDH酶活力單位(mU)＋b，通過Excel等軟件計算 出趨勢線的斜率k和截距b。
根據上述公式計算樣品中LDH活力。
樣品實際吸光度(OD490)＝樣品孔測得的吸光度－背景空白對照孔吸光度
檢測體系中LDH酶活力單位(mU)=(OD490-b)/k
樣品中LDH酶活力(mU/ml)＝檢測體系中LDH酶活力單位(mU )/檢測樣品體積