WB實驗流程 樣本制備的步驟 關于樣本采集和保存，蛋白提取的相關 知識和技巧請查看： 接下來，讓小編帶您總結關于蛋白定量和蛋白變性相關的知識點： 一 蛋白定量 測定蛋白常用的方法有Bicinchoninic acid (BCA)法、Lowry法和Bradford法（考染法） 1. BCA法的測定原理是蛋白質將銅離子還原成亞銅離子，后者在堿性溶液中與BCA結合生成紫紅色結合物，該復合物在562nm處有吸光值且與蛋白質濃度成正相關性，據此可測定蛋白質濃度?？捡R斯亮藍在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合后變為青色，蛋白質—色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。 2. Lowry法又稱為Folin-酚試劑法，首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin-酚上級），產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色，這種深藍色的復合物在745~750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺（吸收值）與蛋白質濃度成正比，可根據750nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量。 3. Bradford法又稱為考染法。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高，可檢測到微量蛋白，操作簡便，試劑配制極簡單，重復性好，但干擾因素多?？捡R氏亮藍G-250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當它通過疏水作用與蛋白質結合后，變成藍色，最大吸收波長從465nm轉移到595nm處，在一定的范圍內，蛋白質含量與595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。 三者之中，Lowry法與BCA同屬化學法，Lowry法是藥典中使用的蛋白濃度測定方法，但是操作繁瑣，實驗時間長。BCA法操作簡單，時間短，形成的顏色復合物穩定性強，但可能受一些雜質影響。Bradford屬于染料結合法，也易受到去垢劑影響。 二 蛋白變性 蛋白變性常用方式是高溫煮樣，煮樣條件設置為100℃，根據樣品量的多少，設置時間5~15min，煮樣時間過長，一些蛋白可能會產生聚集性沉淀。疏水性極強的蛋白質，如含有多個跨膜結構域的蛋白質，在煮沸時可能會發生聚集或寡聚化，因此，其煮樣條件為40℃~55℃條件下，溫浴10~60min變性。煮樣后的樣本于-20℃或-80℃保存。 提取并定量后，并未加Loading Buffer煮樣的蛋白樣品，保存于-80℃時，防止反復凍融，并盡量于1周內加Loading Buffer煮樣處理，最好不要超過2周。 在此，為了幫您更好地完成實驗，我們推薦索萊寶蛋白定量和蛋白變性相關的配套產品。 產品名稱 產品貨號 Bradford法蛋白濃度測定試劑盒 BCA蛋白濃度測定試劑盒 Lowry法蛋白濃度測定試劑盒 4×蛋白上樣緩沖液 （含DTT） 4×蛋白上樣緩沖液 （含巰基還原劑） 4×非變性蛋白上樣緩沖液
教你成為平淡無奇的WB實驗小能手—樣本制備篇
作者：北京索萊寶科技有限公司 2021-01-29T10:17 (訪問量:9022)
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