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圖1 人體不同器官單細胞圖譜的構建
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? ? ? ?美國太平洋時間2017年10月16日，與“人類基因組計劃”相媲美的“人類細胞圖譜計劃” 首批擬資助的38個項目正式公布。清華大學張學工實驗室憑借豐富的單細胞轉錄組生物信息分析經驗成功獲得部分項目基金，成為唯一一個承擔該項目的中國科學家團隊。
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圖2 人類細胞圖譜計劃首批38個項目
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? ? ? ?人類細胞圖譜計劃（Human Cell AtlasProject）是一項大型國際合作項目，由麻省理工學院和哈佛大學等多家單位于2016年發起，根據獨特的分子信息（如基因表達）對所有人類細胞種類進行定義，并將這些信息與傳統的細胞學表述（如位置和形態）相關聯；致力于建立一個健康人體所包含的所有細胞的參考圖譜，包括細胞類型、數目、位置、相互關聯與分子組分等。該計劃是通過全世界范圍內優秀的生物學家、技術專家、病理學家、內科醫生、外科醫生、計算機科學家、統計學家等共同討論，而提出一個具有劃時代意義的國際合作大項目。
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? ? ? ?2017年9月，中國成立人血細胞分子圖譜（ABC）研究聯盟，全面解析并繪制單細胞水平的正常人以及各類血液病患者的血細胞分子圖譜及其異質性規律。此外，其他器官的分子細胞圖譜研究也如火如荼的開展。
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圖3 人類細胞圖譜計劃 MIT+哈佛大學
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? ? ? ?利用ChromiumTM Single Cell 3' Solution平臺，研究人員可以對人體各種細胞進行測序，獲得人體單細胞的轉錄組圖譜，并基于基因表達將細胞分類，定義新的細胞，繪制所有細胞及其分子的空間組織方式，探索人體各個器官復雜的基因網絡在單個細胞中的運作機制，并了解各個細胞中這些網絡的差異，以及各種細胞群體最終如何協同工作。那么ChromiumTM Single Cell 3' Solution如何幫助我們開展細胞圖譜構建呢？小編整理了2篇文章，供您參考。
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大規模單細胞轉錄組構建 人和小鼠胰腺細胞群體內和 群體間的結構圖譜
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A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and MousePancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure
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期刊：《Cell Systems》 發表時間：2016.10 影響因子：8.046 發表單位：哈佛大學、以色列理工大學
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? ? ? ?胰腺的大部分（95%）由兩個外分泌細胞組成：腺泡和導管細胞。腺泡細胞產生消化酶，導管細胞分泌碳酸氫鹽，并運輸消化酶到腸通道。胰腺剩余的5%是胰島，分散在外分泌組織和導管內，包含了分泌維持血糖穩定的激素的內分泌細胞。胰島包含五種內分泌細胞類型，α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞和ε細胞。
圖4 胰島的組成
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? ? ? ?本研究使用基于液滴原理的大規模單細胞轉錄組測序方法，繪制人和小鼠12，000多個胰腺細胞的轉錄譜；為后續發現新的細胞類型、特異性的轉錄因子、信號受體以及治療相關基因提供參考。
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2.1 液滴平臺，分離4個人10，000個和2只小鼠的2，000個胰腺細胞，共12，000個細胞進行單細胞轉錄組測序，每個細胞10萬reads數。其中人的胰腺細胞來自于4個捐贈者、小鼠的胰腺細胞來自于2個小鼠的品系。
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2.2 免疫組化研究：FFAR4/GPR120、MUC1 and CFTR。
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? 3.1 單細胞測序鑒定了胰腺細胞類型的表達譜亞群 ? 12，000個細胞過濾后包含了8，629個細胞來自于4個人以及1，886個來自小鼠每個細胞大約6，000個轉錄本、2000個基因。通過聚類分析，將人和小鼠分別分為14和13個亞群，并展示了每個亞群的特征性基因（圖5）。 ? 圖5 人和小鼠胰腺細胞分群圖和特征基因聚類圖 ? 3.2 細胞亞型之間的關系解釋了人和小鼠品系之間一致的細胞類型 ? 分析在人和小鼠上檢測到的所有細胞類型，我們發現了在人和小鼠上幾乎相同的細胞關系模式圖（圖6）。 ? 圖6 人和小鼠細胞亞型關系的系統樹圖 ? 此外，分析了同一物種不同個體之間細胞類型的一致性，比較了人1和人3的導管細胞，相關系數R2=0.92,遠高于同一捐贈者不同細胞類型的相關系數R2=0.72，表明細胞類型的平均轉錄是保守的(圖7)。 ?
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圖7 不同捐贈者導管細胞的相關性分析（圖C）和
不同捐贈者的不同細胞亞型間的相關性分析熱圖（圖D）
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3.3 內分泌特異性基因表達
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? ? ? ?測序數據還提供了一個研究基因表達的寶庫。比如與藥物研發相關的FFAR4，與β細胞的功能成熟相關的UCN3、與遺傳相關的 DLK1、人類疾病小鼠模型相關的LEPR（圖8）。
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圖8 特征基因在不同亞群表達的小提琴圖
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? ? ? ?針對FFAR4/GPR120 的激動劑目前正在開發用來治療糖尿病，因為他們發揮著類似于胰島素的作用，可以降低血糖。本研究發現人類的β細胞和δ細胞同時表達FFAR4基因，為了進一步驗證，接下來我們對胰島進行免疫組化染色（圖9），發現確認FFAR4存在于這兩種細胞中，推翻了之前認為FFAR4只存在于δ細胞中的結論。
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圖9 特征基因表達的熒光免疫組化圖
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3.4 胰腺星狀細胞激活和施旺細胞分化的特征
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? ? ? ?胰腺星狀細胞與胰腺導管腺癌生成和轉移、胰腺的纖維化、胰腺癌的異常的免疫表型密切相關。之前研究發現星狀細胞分為靜止狀態和激活狀態2個亞型，而通過單細胞測序發現人激活狀態的細胞又分為了2類，分別是免疫激活星狀細胞和標準激活星狀細胞。
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圖10 星狀細胞亞群特征基因熱圖
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? ? ? ?還有一類有趣的細胞是神經脊，我們假設是施旺細胞，但是這類細胞的髓鞘表達是很低甚至沒有的。里面有一些跟神經損傷后的應激基因表達上調。因此我們把這類細胞認定為因為提取和培養而引起分化的施旺細胞。
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3.5 β細胞異質性
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? ? ? ?通過PCA分析發現，區分不同功能的β細胞的不是基因的數量，而是特征性基因的表達（圖11）。總結來說：PC1值低的基因主要與內質網的應激功能相關、PC1值高的基因主要與β基因功能一致。內質網應激，也就是β細胞的未折疊蛋白反應是由高水平的胰島素合成引起的。由于胰島素分泌的高需要，β細胞參與到內質網應激反應。
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圖11 β細胞特征基因的PCA分析
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3.6 單細胞測序與大量細胞測序結果的比較
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? ? ? ?通過調整了大量細胞中細胞的比例變化后，發現之前找到的2，369個差異基因，在調整細胞比例的變化后，差異不存在顯著性；并且找到了233個之前認為沒有差異的基因。
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圖12 大量細胞測序與單細胞測序結果的差異
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? ? ? ?本研究構建人和小鼠的胰腺細胞的轉錄本圖譜，將它們比對到已知的細胞類型，并指出它們的功能，讓我們更清楚的認識了一些之前認識較少的細胞，比如星狀細胞。
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? ? ? ?此外，之前通過大量細胞測序確定為在糖尿病患者和健康獻血者之間差異表達的基因，可能是僅僅因為細胞類型比例變化引起的，也就是假陽性，或者因為細胞比例的變化而隱藏了一些變異，也就是假陰性。而我們通過群體單細胞測序更為精準的尋找基因表達的變化，從而確定糖尿病發生時細胞微環境的變化以及發生的機制。
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大規模單細胞轉錄組測序 構建單胚胎心肌細胞的亞群 以及細胞圖譜
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Transcriptomic Profiling Maps Anatomically PatternedSubpopulations among Single Embryonic Cardiac Cells
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期刊：《Developmental Cell》 發表時間：2016.11 影響因子：9.338 發表單位：斯坦福大學醫學院、中國科學院生命科學研究所
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? 胚胎基因表達復雜地反映了解剖學環境、發育階段和細胞類型。為了解決心臟細胞的精確空間來源是否可以從他們的轉錄譜中推斷出來，本文通過對心臟發育的多個階段進行群體單細胞測序，并通過區域分類算法構建了心臟發育早期的解剖圖譜。還揭示了在器官發育中特定位置單個細胞的基因表達如何被調節。這些研究成果將有助于發現早期心臟發育和疾病發生的新機制。 ? 地 址： 北京市亦莊經濟技術開發區科創六街88號，亦莊生物醫藥園C座 聯系人： 市場部 電 話： 400-9968-999 傳 真： Email：1@capitalbiotech.com
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