盡管最近FDA批準的治療方法取得了進展，但急性髓細胞白血病(AML)仍然是一種難以治療的疾病，很少有患者能得到長期緩解1。
2021年11月美國德州大學安德森癌癥中心發表在《Blood Advances》上的一篇論文中，研究人員對復發/難治性(R/R)的AML患者進行了一項2期試驗。這些患者接受了阿扎胞苷與PD-1檢查點抑制劑尼沃魯單抗的聯合治療1。與只接受阿扎胞苷治療的患者相比，這些患者顯示了良好的反應率(33%)和中位無事件生存期和總生存期。此外，經評估，阿扎胞苷/尼沃魯單抗聯合治療具有可接受的安全性。
在這項研究中，研究小組利用單細胞多重免疫測定來測量16名接受阿扎胞苷/尼沃魯單抗治療的R/R AML患者治療前骨髓中CD4+和CD8+T細胞的功能狀態。他們發現效應性CD4+T細胞具有明顯的多功能組，并與陽性反應結果有關性，而CD8+T細胞沒有明顯的多功能性或藥物反應1。
IsoPlexis的單細胞功能表型平臺提供關鍵的預測指標
接受阿扎胞苷/尼沃魯單抗聯合治療的AML患者，通常有短期陽性治療效果，但長期治療效果卻很罕見。該研究小組利用IsoPlexis單細胞功能蛋白質組學技術來研究哪些在治療前的骨髓浸潤免疫細胞亞群與治療后反應有關，并找出在這個亞群那些細胞因子驅動更高的多功能性。
?
圖1：CD4及CD8單細胞多功能細胞比例
分析結果揭示每個病患的骨髓浸潤免疫細胞里有不同程度的多功能CD4+T及CD8+T細胞。多功能單細胞是指能共分泌至少2個或更多細胞因子的單個細胞。圖1顯示對治療有反應的患者有更高比例的多功能CD4+T和CD8+T細胞亞群。
圖2：CD4及CD8多功能強度指數(PSI)
圖3：不同類型細胞因子分群數據圖
該研究組進一步利用IsoPlexis的多功能強度指數(Polyfunctional Strength Index, PSI)將所有的單細胞多維數據匯總為一個單一的指數。PSI定義為多功能細胞的百分比乘以這些細胞分泌的蛋白質的平均熒光強度(MFI)。該數指數通過IsoPlexis的軟件——IsoSpeak進行分析獲取PSI數據圖表。PSI圖利用顏色來顯示不同類別的細胞因子的貢獻，例如：效應性、刺激性、化合吸引性和調節性細胞因子等，也能將不同類別的細胞因子分群進行分析，如圖3。
圖2里CD4+T與CD8+T細胞亞群的PSI相比，可以顯著的顯示對治療有反應的患者和無反應的患者PSI的差別。在對治療有反應的患者的CD4+T和CD8+T細胞亞群中，抗腫瘤相關蛋白的分泌量比無反應者有更大的增加。PSI指數比起多功能性細胞比例數據（圖1）提供更顯著的相關性。例如：CD4+T細胞亞群多功能細胞百分比p值為0.0362，而CD4+T細胞PSI的p值是0.0128。
?
圖4：PSI與AML病患總存活率（按月計算）相關性
研究小組也得到了一個很有趣而且很重要的發現。盡管對檢查點阻斷的反應一直以來被認為是由CD8+T細胞主導的，但IsoPlexis技術顯示是CD4+T細胞的PSI跟存活率相關性更好（圖4）。有陽性治療反應的AML患者在接受聯合治療前骨髓細胞里有明顯高比例的多功能的CD4+T細胞亞群。這非常重要的發現證實了CD4+T免疫細胞群體對檢查點抑制劑治療能有效反應的重要性，也顯示了多功能的CD4+T細胞是潛在的生物標記，可以在用藥前預測病人對治療的反應。
圖5：3D-tSNE揭示PD-1藥物治療前骨髓CD4+和CD8+細胞亞群中多功能細胞比例及分泌的細胞因子
?
除了多功能細胞百分比及PSI數據圖，IsoSpeak也提供了3D-tSNE（圖5）和多功能熱圖（圖6）。3D-tSNE （圖5）通過根據細胞因子的最大功能差異對樣本進行分層。有反應的AML患者的CD4+T和CD8+T中具有抗腫瘤相關蛋白分泌物的多功能細胞亞群比沒反應患者的亞群明顯增加（紫色圓圈突出顯示）。捐贈者小組(Donor Groups)的細胞圖從有反應患者（橙色）和沒反應患者（藍色）的樣本中劃分數據點。而主導功能組(Dominant functional group)通過顏色標記主要細胞因子的分泌情況，顯示生物驅動因素。
圖6：多功能熱圖揭示抗PD-1治療前的骨髓CD4+和CD8+細胞亞群中不同的細胞因子與強度
?
多功能熱圖（圖6）比較了樣本分泌各種單功能和多功能組的頻率。熱圖顯示，與沒反應的AML病患相比，有反應的病患的CD4+T和CD8+T細胞亞群中具有獨特細胞因子特征的多功能亞群的上調幅度更大（綠色矩形為突出顯示）。
在文獻的尾端，作者總結說：“治療前PSI值推測與CTLA4、PD-L1、TIM3以及其他基于T細胞策略的AML臨床試驗的治療結果也是正向關聯，期待可以在AML免疫治療中做為潛在的生物標志物。”
結論
?
治療AML并非易事。它是一種侵略性的癌癥，需要在診斷后立即采取行動。這項研究強調IsoPlexis的單細胞功能表型平臺的潛在預判能力。是目前唯一能揭示真正單細胞功能洞察力的技術，可望加速下一代治療的發展。這項研究是其中一個例子說明IsoPlexis如何為癌癥研究的產品特性鑒定和優化提供關鍵的預測指標。
參考文獻
1. Abbas HA, Alaniz Z, Mackay S, Cyr M, Zhou J, Issa GC, Alfayez M, Matthews J, Kornblau SM, Jabbour E, Garcia-Manero G, Konopleva M, Andreeff M, Daver N. Single-cell polyfunctional proteomics of CD4 cells from patients with AML predicts responses to anti-PD-1-based therapy. Blood Adv. 2021 Nov 23;5(22)4569-4574.
IsoLight全自動單細胞功能蛋白質組學分析系統
高度集成的系統，包含液體處理器、清洗站、顯微鏡、細胞培養裝置、微陣列掃描儀的高端分析系統，單次24小時內自動化完成8個芯片的檢測。
IsoCode微流控單細胞分泌蛋白組芯片
每張芯片里含有12,000個獨立的亞納升級別的微室，結合微流控技術，可以捕獲500-1,500個單細胞。此外，獨特的抗體編碼技術可實現單細胞水平上多達32種因子的檢測。
IsoSpeak多維生信分析軟件
自動化生物信息分析軟件，按鈕式界面設計，直觀易使用，結果可視化，綜合性的定量指標——多功能強度指數(PSI)，可揭示復雜的單個細胞多個因子應答的統計學數據。
?
?
?
?
成立于2013年的IsoPlexis公司總部位于美國的康涅狄格州，是一家專注于單細胞多重功能蛋白質檢測解決方案的**供應商。自2018年商業化以來，已在全球成功裝機超過200臺，是眾多國際知名研究機構和制藥廠商的合作伙伴，相關文獻發布超過100篇，并有多篇高分文章發布在Nature、Cell、Immunity等刊物上。
IsoPlexis致力于提供業內廣受贊譽的精準單細胞分析系統，助力加速對抗癌癥及各種疑難病癥的進程。通過揭示細胞亞群中獨特的免疫生物標志物，推動免疫療法及靶向治療邁向更精準、個性化的發展階段。
?
?
?
?
