淋巴結（LNs）是免疫系統的重要組織，淋巴結內含有重要的免疫細胞如DCs和T細胞。因此將藥物直接送到淋巴結可以很大程度的提高其生物利用度和減少副作用。然而，小分子免疫調節劑的生物藥劑學特性通常導致淋巴吸收不良。已經發現，皮下注射后，納米顆粒將由于內皮細胞通透性的固有間隙，優先流入淋巴管而不是毛細血管?；谶@一觀點，各種納米載體，已被用于靶向淋巴傳遞。研究還發現，納米顆粒的淋巴引流能力很大程度上取決于其顆粒直徑的大小和表面性質。一般來說，增加顆粒大小可以增強淋巴結滯留時間，但是會阻礙顆粒從注射部位的引流過程。類似的，可以通過修飾掩蓋納米顆粒與基質的靜電作用來改善納米顆粒的淋巴引流。然而，這也可能抑制他們的淋巴結滯留。因此，淋巴結靶向納米材料的設計應該注重如何平衡快速淋巴引流與最佳淋巴結滯留時間之間的關系。

聚多巴胺（PDA）是多巴胺的聚合形式，是一種存在于大腦中典型的神經遞質。由于其獨特的特性，如內在的生物相容性、強黏附性和強近紅外光吸收，各種基于PDA的材料已經在生物醫藥領域被開發應用。PDA納米粒子（PDA NPs）可以方便的合成，并表現出在結構上負載具有芳香環化合物的能力，如通過π-π堆積和/或疏水相互作用負載阿霉素（DOX）。如果顆粒內刻上介孔，這種載藥能力可進一步提高，如介孔聚多巴胺納米顆粒（MPDA NPs）。此外，PDA NPs的高光熱轉化效率（約40％）保證了用于光熱療法的可行性，通過該性能，不僅可以直接破壞腫瘤細胞，還可以同時釋放腫瘤抗原，從而增強腫瘤組織的免疫原性。迄今為止，很少有關于MAPD NPs作為納米載體用于靶向淋巴給藥的應用證實。

重慶大學蔡開勇課題組以TLR 7激動劑咪喹莫特（R837）為免疫調節模型，設計并應用基于MPDA的藥物給藥系統進行靶向淋巴免疫激活（Fig.1）。將R837高效的負載到MAPD NPs上，并將生物相容性聚合物聚乙烯吡咯烷酮（PVP）通過PVP上的羰基與MPDA NPs上的酚羥基之間的氫鍵相互作用用于表面涂層。所設計的PVP-MPDA@R837納米佐劑與游離R837相比，納米佐劑有明顯優勢能促進樹突細胞（DCs）成熟，而且有在近端淋巴結中轉運和滯留的能力，可以在很大程度上使淋巴藥物暴露最大化，并且結合了MPDA的光熱轉化特性和淋巴聚焦免疫激活，具有很強的抗黑色素瘤的能力。

基本信息

摘 要

Toll樣受體（TLR）激動劑是先天免疫系統的強效興奮劑，有望作為抗癌免疫療法的佐劑。不幸的是，它們中的大多數都受到了迅速傳播的限制，從而導致了“浪費的炎癥”。因此，如何將它們的作用半徑限制在淋巴組織中，對于提高療效并同時減輕副作用具有重要意義。本實驗中，將TLR 7激動劑咪喹莫特（R837）高效負載到介孔聚多巴胺（MPDA）納米載體中，并用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）對其表面進行改性，以增強其淋巴引流能力。與游離R837相比，這些納米佐劑在促進樹突細胞成熟方面具有明顯優勢。此外，它們在近端淋巴結（LNs）中的轉運和滯留能力也得到證實，通過這種轉運和滯留能力，可以在很大程度上使淋巴藥物暴露最大化。因此，通過引流淋巴結釋放的R837，觀察到有效的DCs激活和CD8⁺T細胞反應?；贛PDA的光熱效應誘導的凋亡碎片中內源性腫瘤抗原的存在進一步增強了這種效應，并因此導致皮下B16黑色素瘤的生長抑制。結果表明，所設計的PVP-MPDA@R837納米佐劑結合了MPDA的光熱轉化特性和淋巴聚焦免疫激活，具有很強的抗黑色素瘤的能力。

研究內容及結果

經近紅外照明（808nm，0.5W/cm²）的方法對PVP-MPDA NPs的光熱轉換性能進行了評價。如Fig.2C所示，PVP-MPDA溶液的光熱轉換明顯依賴于粒子濃度。近紅外曝光后，PVP-MPDA溶液(500μg/mL)的溫度在300s內從21.4℃升高到33.8℃，而水的溫度僅升高1.8℃。采用前面方法計算，結果得出PVP-MPDA和MDA NPs的光熱轉換效率（η）分別為38.71%（Fig.2D）和39.51%（Fig.S2）。這意味著表面覆蓋PVP后，MPDA NPs的光熱轉換性能幾乎沒有變化。

2、PVP-MPDA NPs中R837的加載和釋放

據報道，MPDA NPs可以將具有典型芳香族分子結構的藥物或染料，如DOX或Rhodamine B，通過π-π堆積和疏水相互作用物理吸收加載到多孔結構中。根據其化學結構，我們假設R837可以被有效地吸附到MPDA NPs中。將R837與給定數量的MPDA溶液混合，得到不同初始藥物濃度（0-500μg/mL）的吸附等溫線。收集并分析得到的MPDA@R837溶液。如Fig.3A所示，MPDA的吸附量隨著R837濃度升高而逐漸增加，當初始藥物濃度大于400μg/mL時，達到飽和狀態。因此，以500μg/mL的R837加樣濃度制備了載藥率為400μg/ mL(W_R837/W_MPDA)的PVP-MPDA@R837 NPs，用于后續實驗。

PVP-MPDA@R837表現出酸性pH應答型藥物釋放模式(Fig.3B)。在第一個小時中，在pH5.0（模擬內體/溶酶體的pH值）下釋放了約18.69％的封裝R837，在24小時內約48.47％。但是，當pH值為7.4時，在開始的1小時內僅釋放2.12％，隨后在24小時內緩慢釋放（約9.34％）。這種現象可能歸因于溶液中R837的溶解量對pH的依賴性。由于氨基的質子化增加，R837在酸性條件下表現出較高的水溶性。

3、PVP-MPDA NPs體外細胞毒性

考慮到PVP-MPDA NPs在給藥中的應用，評估其生物相容性是至關重要的。MTT法顯示（Fig.3C），劑量達175μg/mL PVP-MPDA NPs的對B16F10細胞幾乎無毒（細胞活力>80%）。這一結果與之前的報告一致，即PDA本身沒有毒性。而在808nm激光照射（0.5W/cm²持續5分鐘）后，細胞存活率以濃度依賴方式明顯下降。當PVP-MPDA NPs的濃度為18μg/mL時，約有50%的細胞存活。然而，當濃度升高至175μg/mL時，僅檢測到21.2％的活細胞，說明PVP-MPDA可以通過光熱效應有效殺死腫瘤細胞。雖然R837一直以其在誘導DCs成熟過程中的顯著作用而聞名，但它可以部分殺傷腫瘤細胞。通過將B16F10細胞與R837，PVP-MPDA@R837在有/沒有近紅外光暴露的條件下孵育來進行細胞的活力測定（Fig.3D）。結果表明，PVP-MPDA@R837組細胞存活率普遍隨藥物濃度的升高而降低。這與等量的游離R837相比略低，可能是由于納米載體延遲了藥物的擴散。值得注意的是，在近紅外照射下，由于光熱誘導的細胞殺傷效應，PVP-MPDA@R837組細胞活力明顯增強。這些數據表明，R837除了具有免疫刺激DCs的主要功能外，還可直接誘導腫瘤細胞死亡，這將在一定程度上提高免疫治療的總體抗腫瘤性能。

4、PVP-MPDA@R837對BMDCs體外活化的研究

樹突狀細胞是最強大的抗原提呈細胞。未成熟DCs的激活對活化初始幼稚型T細胞至關重要，并且能引發T細胞介導的免疫應答。DCs的成熟通常伴隨著協同刺激分子的上調表達和促炎細胞因子的分泌。在實驗中，通過使用流式細胞儀來測定BMDC表面共刺激分子（CD80和CD86）的表達水平，研究PVP-MPDA@R837 NPs的免疫刺激活性。添加PVP-MPDA@R837后，共刺激因子的表達水平明顯上調，表達水平與等量游離R837處理相似，而PVP-MPDA處理與PBS對照之間無明顯差異（Fig.4）此外，通過ELISA檢測促炎細胞因子的釋放，包括TNF-α（一種激活細胞免疫的關鍵標志物）、IL-6和IL-12（先天免疫的關鍵標志物）。結果顯示游離R837或PVP-MPDA@R837處理后細胞因子濃度顯著升高。然而，游離R837組和PVP-MPDA@R837組的之間沒有顯著性差異，PVP-MPDA與PBS對照組之間也沒有顯著性差異。這些結果表明PVP-MPDA NPs沒有顯示增強免疫活性作用的跡象，由PVP-MPDA NPs傳遞的R837仍具有免疫刺激能力。

據報道，熱誘導的癌細胞凋亡可導致腫瘤相關抗原（TAAs）和損傷相關分子模式（DAMPs）的釋放，如熱休克蛋白70（Hsp70）和高遷移率族蛋白-1（HMGB1）。這些物質可誘導有效的免疫應答，而免疫佐劑的引入將進一步增強其刺激程度。本研究采用Transwell實驗研究了在PVP-MPDA@R837存在下，光熱誘導的腫瘤細胞凋亡對BMDCs成熟的影響。如Fig.5所示，將經過各種處理的B16F10細胞放入上層，下層放DCs。分別用流式細胞儀和ELISA檢測樹突狀細胞的成熟和細胞因子的分泌。結果表明，DCs與熱損傷腫瘤細胞共培養時，共刺激因子CD80和CD86的表達水平顯著上調，而PVP-MPDA@R837 NPs的加入進一步增強了這一趨勢。與DCs成熟數據一致的是，激光照射腫瘤細胞孵育后，DCs分泌IL-6、IL-12和TNF-α的水平也有顯著提高。PVP-MPDA@R837組上清細胞因子濃度最高。所有結果表明，通過添加光熱消融的腫瘤細胞，可以進一步增強TLR激動劑對DCs成熟的影響。

5、PVP-MPDA NPs的淋巴結引流

淋巴結是免疫細胞的主要倉庫。據報道，免疫增強劑是否能有效地導入淋巴結，將極大地影響誘導的免疫應答的質量。為了研究PVP-MPDA@R837的在體內淋巴引流情況，將顆粒皮下注射到小鼠足墊，不同時間點分離小鼠的腹股溝和腘窩淋巴結進行了研究。已知足墊是由近端的腘淋巴結引流的，轉而引流向腹股溝淋巴結。立體顯微鏡圖片（Fig.6A）清晰的顯示出， PVP-MPDA NPs注射后24小時逐漸累積在同側腘淋巴結中，并且在96小時內都停留在那里。只有一小部分在48小時后遷移到第二個引流淋巴結（同側腹股溝淋巴結）。與之相對的是，沒有在對側淋巴結中發現這些顆粒的跡象。而且組織切片被核固紅染色液染色也證實PVP-MPDA NPs存在于淋巴結中。Fig.6B明顯顯示PVP-MPDA NP在注射24小時后積累在被膜下淋巴竇和濾泡間區域。這些結果表明，皮下注射后，PVP-MPDA NPs在引流淋巴結內有效的積累，可最大限度地增加淋巴系統的藥物暴露，通過增加DCs與T細胞相遇的機會，促進免疫應答。

6、體內抗腫瘤作用

分別用PBS、R837、PVP-MPDA、PVP-MPDA+NIR、PVP-MPDA@R837、PVP-MPDA@R837+NIR，對B16F10小鼠黑色素瘤模型進行腫瘤生長抑制試驗，每3天免疫一次總共免疫三次（如Fig.7A）。從Fig.7B中可以看出，R837、PVP-MPDA+NIR和PVP-MPDA@R837均只有一般水平的腫瘤生長的抑制作用，與對照組相比，21天時抑制率分別為約23.4%、30.5%和41.2%，PVP-MPDA組無明顯抑制作用。而PVP-MPDA@R837+NIR處理對腫瘤生長的抑制率約為66.3%。另外，PVP-MPDA@R837+NIR組小鼠的存活