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ClonePix結合CloneSelect Imager技術加強開發
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病毒特異性的雜交瘤細胞
? ? ? ? 雙鏈DNA病毒引起人類大多數疾病。皰疹病毒和腺病毒家族和乳頭瘤病毒在人體中會產生相似的癥狀。而且，由于病毒抗原基因組的保守，對于特殊病毒的血清學和蛋白診斷確認是非常復雜的。高度的蛋白同源性和血清交叉反應導致雙鏈DNA病毒物種之間區分是非常困難的。本研究的目的是發現識別最優的分泌高度特異性、無交叉反應的單克隆抗體的細胞系，用于生物治療的開發。
? ? ? ? ClonePix系統用來高通量從母本的雜交瘤細胞中（歷史數據表明母本的細胞系產量少于1mg/L的單抗）篩選數以百計的亞克隆。分泌高IgG的活細胞進一步用客觀評價細胞生長的CloneSelect Imager系統來評估。高效自動化克隆選擇技術旨在挽回高滴度的雜交瘤細胞系，這些細胞系能生產抗原高特異性的抗體。ClonePix和CloneSelect Imager配套技術為免疫診斷技術發展提供了足夠的病毒抗原的特異性抗體。
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材料
l???????? ClonePix System (Molecular Devices, LLC)
l???????? CloneSelect Imager (Molecular Devices, LLC)
l???????? CloneMedia Semi-Solid Media for hybridomas/myelomas (Molecular Devices, LLC Cat #K8600/K8610)
l???????? CloneDetect Reagent, Mouse IgG (H+L) Specific,Fluorescein (Molecular Devices, LLC Cat #K8220)
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挽救低產量的雜交瘤細胞
? ? ? ? 最早的雙鏈DNA 病毒特異性雜交瘤細胞系是1990s用有限稀釋方法開發的，但是篩選的雜交瘤細胞單克隆性和穩定性都不是很好。用不同的血清和培養基組分進行多年的重復培養（靜態的和旋轉的），這些克隆表現出不穩定（圖1）。而且，抗體的產率從來沒有超過3mg/L。由于在preps中能觀察的差別巨大的聚集物，使得純化的IgG的質量很難保持一致性。
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通過亞克隆高滴度抗體的親本細胞系，挽回和穩定特異性的雜交瘤細胞系。ClonePix技術平臺利用半固體培養基和CloneDetect無標記檢測技術重篩了大量以前融合的雜交瘤細胞（圖2），顯示了明顯的技術優勢。
ClonePix高通量篩選方法能夠從低產的親本克隆細胞中挽回高產、穩定的細胞。
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篩選和識別中試規模分析的亞克隆
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用合成的具有抗體表位的多肽，對篩選到的前146生長速率的克隆進行抗原特異性分析。多肽和抗體顯示了很強的的親和性，完全符合前期研究的闡釋，因此，合成的多肽用來篩選新的，具有高抗體親和性的亞克隆。?
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高IgG分泌亞克隆的中試規模生產
7個高價值特異的亞克隆在液體培養基規?；a。這些克隆被擴增，一旦獲得足夠的培養基體積，5個亞克隆被冷凍用于將來的研究參考。而剩下的2個高親和/高IgG分泌克隆繼續擴增2-3周，直到完成中試生產（1升）。
挽救低產量雜交瘤細胞的工作流程
為了識別用于發展高級診斷的雙鏈DNA病毒特異抗體的亞克隆，ClonePix技術篩選480FITC陽性的雜交瘤克隆，基于半固體培養基技術和FITC標記的CloneDetect試劑。CloneSelect Imager 識別了其中146個快速生產的克隆，7個高產量的克隆被確認和目標多肽具有高度的特異性。選擇其中的2個亞克隆進行中試生產和剩余的5個作為細胞銀行。這個流程降低了雜交瘤細胞的篩選時間，最多為常規有限稀釋法篩選時間的50%，而且篩選了強健的目標克隆細胞作為其他附加的研究和生產。
單克隆的驗證和IgG分泌子的均一化
ClonePix系統再克隆和特異性確認之后，2個亞克隆擴增，重新種到具有CloneDetect試劑的半固體培養基的6孔板中。ClonePix系統成像和分析表明克隆正常的分泌了IgG，同時，通過均相均一化過程，能觀察到高產IgG的克?。▓D5）。
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新雙鏈DNA病毒雜交瘤細胞亞克隆的生產能力
利用ClonePix技術重新篩選低產量的親本克隆。高產、穩定的亞克隆被挽回。Protein G純化單克隆抗體，定量總產量。相比親本克隆的歷史產量（~1mg/L），新的亞克隆細胞IgG的產量明顯地增加（17-25mg/L），圖6顯示。 ??
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結論
ClonePix技術改善了篩選時間周期和亞克隆雜交瘤細胞的質量，降低手動操作。而且，CloneMatrix Media和CloneDetect 試劑提高了分泌克隆的生長和檢測靈敏度。ClonePix的數據表明親本的低生產力源于小數目生產抗體的細胞被快速、無生產抗體能力的細胞壓制。
相比親本雜交瘤細胞的產量（05-1mg/L）， 結合CloneSelect Imager的使用，ClonePix 系統被證明是能識別高產（17-25mg/L）、高親和力雜交瘤細胞亞克隆的強有力工具。因此，該技術有助于推進雙鏈DNA病毒特異性的新治療性抗體的發展。
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需要了解更多信息，請聯系AbiPointe Biotechnology，Info@abipointe.com
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