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線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10)

品牌：Solarbio | 貨號：CA1310

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產(chǎn)品說明：線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-10 ）是一種以 JC-10 為熒光探針，快速靈敏地檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試 劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測。

JC-10 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△ Ψm 的理想熒光探針。可以檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電 位較高時，JC-10 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-10 不能聚集在線粒體的基 質(zhì)中，此時 JC-10 為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠 熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過 JC-10 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜 電位的下降，同時也可以用 JC-10 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。 JC-10 單體的最大激發(fā)波長為 515nm，最大發(fā)射波長為 529nm；JC-10 聚合物的最大激發(fā)波長為 585nm ，最大發(fā)射波長為 590nm。 實(shí)際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。

本試劑盒提供了 CCCP 作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測 100 個樣品；對于 12 孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測 200 個樣品。?

產(chǎn)品內(nèi)容：

保存條件：-20 ℃避光保存，盡量避免反復(fù)凍融，有效期一年。 超純水和 JC-10 染色緩沖液（5 ×）也可 4 ℃保存。?

操作步驟：

1、JC-10 染色工作液的配制：

六孔板每孔所需 JC-10 染色工作液的量為 1mL，其他培養(yǎng)器皿的 JC-10 染色工作液的用量以此類推；對于細(xì)胞懸液每 50～100 萬細(xì)胞需 0.5mL JC-10 染色工作液。取適量 JC-10（200×），按照每 50μL JC-10（200 ×）加入 8mL 超純水的比例稀釋 JC-10。劇烈 震蕩充分溶解并混勻 JC-10。然后再加入 2mL JC-10 染色緩沖液（5 ×），混勻后即為 JC-10 染色工作液。

2、陽性對照的設(shè)置：

把試劑盒中提供的 CCCP（10mM）推薦按照 1∶1000 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至 10μM，處理細(xì)胞 20 分鐘。隨后按 照下述方法裝載 JC-10，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì)胞，通常 10μM CCCP 處理 20 分鐘后線粒體的膜電位會完全喪失， JC-10 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng) JC-10 染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可 能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定。

3、對于懸浮細(xì)胞：

(1) 取 10～60 萬細(xì)胞，重懸于 0.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

(2) 加入 0.5mL JC-10 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37 ℃孵育 20 分鐘。

(3) 在孵育期間，按照每 1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-10 染色緩沖液（1×），并放 置于冰浴。

(4) 37℃孵育結(jié)束后，600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

(5) 用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次：加入 1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，沉淀細(xì) 胞，棄上清。再加入 1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。

(6) 再用適量 JC-10 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測或流 式細(xì)胞儀分析。

4、對于貼壁細(xì)胞：

注意：對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

(1) 對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用 PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入 1mL 細(xì)胞 培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

(2) 加入 1mL JC-10 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20 分鐘。 (3) 在孵育期間，按照每 1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-10 染色緩沖液（1×），并 放置于冰浴。 (4) 37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次。

(5) 加入 2mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

(6) 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、對于純化的線粒體：

(1) 把配制好的 JC-10 染色工作液再用 JC-10 染色緩沖液（1×）稀釋 5 倍。

(2) 0.9mL 5 倍稀釋的 JC-10 染色工作液中加入 0.1mL 總蛋白量為 10～100 μg 純化的線粒體。 (3) 用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時間掃描（time scan），激發(fā)波長為 485nm ， 發(fā)射波長為 590nm 。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為 485nm 時，可以在 475～520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也 可以參考下面步驟 6 中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測。 (4) 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6 。

6、熒光觀測和結(jié)果分析：

檢測 JC-10 單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm ，發(fā)射光設(shè)置為 530nm ；檢測 JC-10 聚合物時，可以把激發(fā)光設(shè)置為 525nm ， 發(fā)射光設(shè)置為 590nm 。

注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-10 單體 時可以參考觀察其它綠色熒光時的設(shè)置，如觀察 GFP 或 FITC 時的設(shè)置；檢測 JC-10 聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化 丙啶或 Cy3 時的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電 位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

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注意事項(xiàng)：

1. JC-10 （200×）在 4 ℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以 20～25℃水浴溫育片刻至全部 融解后使用。

2. 必須先把 JC-10（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入 JC-10 染色緩沖液（5×）。不可先配制 JC-10 染 色緩沖液（1×）再加入 JC-10（200×），這樣 JC-10 會很難充分溶解，會嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測。

3. 裝載完 JC-10 后用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌時，使 JC-10 染色緩沖液（1×）保持 4 ℃左右，此時的洗滌效果較好。

4. JC-10 探針裝載完并洗滌后盡量在 30 分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

5. 請勿把 JC-10 染色緩沖液（5×）全部配制成 JC-10 染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用 JC-10 染色緩沖液（5×）。

6. 如果發(fā)現(xiàn) JC-10 染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在 37℃加熱。

7. CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護(hù)。

8. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。