2.ReV在結腸炎組織中的有效蓄積情況

受紅細胞循環持續時間的啟發，紅細胞表達膜蛋白，如CD47，有助于防止被MPS清除，作者首先選擇微尺寸的RBC（約5.8μm）和納米尺寸的ReV（約140nm），以比較大小對累積的影響（圖2a）。此外，作者選擇了與ReV大小相似的聚乳酸-乙醇酸納米顆粒（NPs），以比較不同材料的累積能力。作者通過監測靜脈注射后的循環持續時間來比較這三種攜帶者。健康小鼠和結腸炎小鼠（由3%DSS誘導）的結果相似。具體而言，NPs被迅速清除，半衰期短約1.2小時，而RBC和ReV的半衰期則長得多（圖2b）。對于外滲，作者使用四甲基羅丹明異硫*酸酯–右旋糖酐作為血管內對比劑，在體內進行雙光子熒光顯微鏡檢查（圖2c和d）。在健康組織和結腸炎組織中，NPs的短循環幾乎不會導致血管的信號外滲。盡管長循環的紅細胞可以稍微改善這種情況，但它們的微小尺寸限制了結腸炎患者通過血管內皮細胞破裂的間隙進行的外滲。值得注意的是，具有長循環和納米尺寸的ReV顯著改善了其外滲，尤其是在結腸炎組織中。因此，主要器官（結腸、心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）的離體成像顯示納米級ReV，而不是其他材料在結腸中顯示出明顯的堆積（圖2e和S2）。為了定量，作者計算了結腸和肝臟中這些載體的強度比（圖2f）。NPs和RBC的比率分別為0.09和0.2，健康和結腸炎小鼠之間無顯著差異。相反，健康小鼠的ReV比率約為0.35，結腸炎小鼠的ReV比率甚至達到0.9。在熒光信號方面，特別是在炎癥結腸中，ReV的熒光信號比RBC高約4.5倍，比NPs高10.4倍，這表明ReV是作為治療腸道炎癥疾病載體材料的好候選材料。

3.氧化鈰納米顆粒功能化ReV

據報道氧化鈰納米顆粒是一種有前途的活性氧清除材料，ReV作為炎癥部位聚集的優良載體，作者接下來用氧化鈰納米顆粒功能化ReV，以提高對結腸炎的治療性能。為此，作者開發了一種單一且溫和的一鍋法。從健康小鼠的抗凝管中收集紅細胞，并制備納米級ReV，在Ce³⁺溶液（1mM，pH=6.2）中培養。由于靜電作用，Ce³⁺可以吸附在ReV膜上。去除多余的Ce³⁺并將介質pH值調節至7.4后，在ReV膜上原位生長氧化鈰納米晶體（圖3a），通過透射電子顯微鏡（TEM）圖像（圖3b）和能量色散光譜（EDS）元素分析（圖3c）進行驗證。結果顯示，Ce-ReV保留了與ReV相似的形態和尺寸（圖S3a），而在ReV膜上觀察到許多直徑小于3nm的氧化鈰納米晶體。使用電感耦合等離子體（ICP）-質譜（ICP-MS），發現鈰的負載量約為1.6 μg/10¹¹個囊泡。有了Ce-ReV，作者使用電子自旋共振（ESR）光譜進一步測試了Ce-ReV的ROS清除性能。向分析物溶液中添加Ce-ReV后，羥基自由基、氮自由基和超氧陰離子的水平以劑量依賴的方式明顯降低（圖3d）。以20μg/mL（Ce質量）的劑量為例，Ce-ReV可以完全清除三種類型的ROS，其光譜接近基線。然而，當使用相同劑量的傳統CeO₂?NP進行比較時，ESR信號的振幅降低。

為了驗證Ce-ReV活性氧清除性能強于傳統CeO₂?NPs，作者使用活性氧清除檢測試劑盒進行定量檢測。正如預期的那樣，在同等Ce質量下，Ce-ReV的ROS清除活性大約比CeO₂?NP高3倍（圖S4），因此強調了ReV作為活性增強的氧化鈰原位生長模板的作用。除了氧化鈰納米晶體，作者還進一步研究了它們對ReV的影響。由于制備條件非常溫和，SDS-PAGE分析顯示結晶后膜蛋白組分沒有明顯變化（圖S3b）。特別是，Western Blotting（圖S3c）顯示Ce-ReV和ReV表達相似水平的CD47，這導致了相似的循環行為?？紤]到氧化鈰納米晶體的參與，作者評估了Ce-ReV的生物相容性和穩定性。正如預期的那樣，與紅細胞混合后未觀察到明顯的溶血（圖3e和S5a），與各種細胞系孵育后幾乎未檢測到細胞毒性（圖3f），靜脈注射Ce-ReV后未觀察到對血液循環和血管結構的影響（圖S6和S7）。就穩定性而言，在含有10%胎牛血清（FBS）的細胞培養基中培養48小時后，Ce-ReV中的Ce含量保持在90%以上（圖3g），這表明很少有氧化鈰納米晶體從ReV中分離。此外，在凍干/復水循環之前（左）或之后（右）（圖3h）或在4°C磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中儲存1周期間（圖3i），未觀察到顆粒大小或zeta電位的明顯變化。使用人類的紅細胞時，也可以觀察到具有良好活性、生物相容性和穩定性的氧化鈰成功原位生長的類似結果（圖S8和S5b）。

4.探究ReV上氧化鈰納米晶生長機理

據報道，氧化鈰納米晶的尺寸和鈰價態是活性氧清除性能的兩個重要因素。具體來說，較小的尺寸可以釋放更多的氧氣并增加更多催化部位的表面積比，并且根據Ce³⁺狀態的比例可以實現更多的氧氣不足以提高催化活性。因此，作者接下來評估ReV這兩個方面的組成部分的影響。鑒于細胞囊泡主要由蛋白質和脂質組成，作者首先使用TEM研究了在蛋白質（牛血清白蛋白）和脂質（1-棕櫚?；?2-油?；蚜字?，POPC）膜存在下氧化鈰結晶的過程。同時，將水和水熱條件下的結晶作為對比（圖4a）。POPC存在下形成的氧化鈰具有超小的尺寸，這與在ReV膜上觀察到的尺寸相似（小于3 nm），而在其他條件下形成的氧化鈰顯示出更大的尺寸或明顯的聚集。

X射線光電子能譜（XPS）分析表明，膜和POPC反應生成的氧化鈰納米晶體中三價鈰離子的比例最高（高達60.8%）（圖4b）。為了證實脂質分子的重要作用，作者使用Cyro-TEM觀察氧化鈰在POPC膜上隨時間變化的結晶（圖4c）。由于Ce³⁺的預吸附，一次氧化鈰成核最初發生在膜上。隨著時間的推移，成核逐漸長大并形成超小型氧化鈰納米晶體。作者進行了一系列密度泛函理論（DFT）計算，以更好地理解氧化鈰結晶過程中脂質分子的潛在機制（圖4d）。計算數據表明，在脂質存在下，氧化鈰納米晶的形成有兩個因素：電荷轉移和成核勢壘。具體而言，POPC的存在削弱了Ce³⁺在水系統中的電荷轉移，從2.35e降低到1.61e，促進了較高比例的Ce³⁺。此外，POPC的存在將氧化鈰納米晶的成核勢壘從水系統中的189.60降低到87.77，最終導致形成更小尺寸的氧化鈰納米晶（圖4e，f）。這些結果有助于理解氧化鈰納米晶體的表面積和價態是如何被脂質分子操縱的，而這種模板效應以前從未實現過。

5.Ce-ReV的治療效果與潛在機制

在DSS誘導的結腸炎小鼠模型中測試了Ce-ReV的治療潛力。在第1天、第3天和第5天，這些小鼠靜脈注射PBS、ReV、CeO₂或Ce-ReV（Ce的等效劑量為800μg/kg）。為了評估整體治療效果，在9天內記錄體重變化，并在第9天對小鼠實施an le死，以測量結腸長度（圖5a）。正如預期的那樣，ReV單獨治療在體重減輕和結腸長度減少方面沒有顯示任何治療效果，這與PBS治療組相似。由于催化活性不理想，傳統的CeO₂及其在結腸炎組織中積累不足（圖S9），使用CeO₂治療未能實現體重和結腸長度的實質性改善。相反的是，與健康組相比，在炎癥結腸組織中具有強催化活性和有效積累的Ce-ReV在結腸炎小鼠中顯示出良好的治療效果，體重和結腸長度僅略有減少（約5%）（圖5b，c）。

為了更好地理解Ce-ReV治療效果的潛在機制，作者進行了二氫乙胺（DHE）染色以檢測結腸組織中ROS的數量（圖5d-f）。Ce-ReV治療組的三維（3D）重建雙光子顯微圖像和冰凍切片結腸組織顯示的信號強度均比PBS、ReV和CeO₂治療組弱得多。ROS產生的顯著數量促使作者進一步研究其與炎癥的關系；因此，作者進行了轉錄組分析，差異表達基因的層次聚類分析顯示，Ce-ReV治療顯著下調已知的炎癥基因（如Ifi202b、Il11和Tlr2），限制炎癥反應的基因（如RasGRP3和Cd83）同時上調（圖5g）。KEGG分析揭示了已知炎癥途徑的豐富，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素17（IL-17）信號途徑（圖5h）。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）進一步證實了Ce-ReV治療的抗炎作用，該實驗顯示促炎細胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）和髓過氧化物酶（MPO）的水平受到顯著抑制（圖5i）。結果表明炎性細胞浸潤和隱窩缺失均被顯著抑制（圖5j和S10）。值得注意的是，Ce-ReV的良好治療效果也得到了臨床上廣泛使用的其他傳統結腸炎療法（如5-ASA和地塞米松）優勢的證實。以結腸長度為例，與健康小鼠相比，Ce-ReV組僅顯示約5.7%的減少，而5-ASA治療后仍觀察到約25.5%的減少（圖S11）。除治療結果外，Ce-ReV治療沒有在健康小鼠中誘發任何可檢測的全身毒性（圖S12），包括體重、血液學、血液化學和主要器官組織學特征的變化?？偟膩砜?，這些體內實驗結果支持Ce-ReV作為一種安全有效的治療藥物，用于對抗3%DDS誘導的結腸炎小鼠模型。

6.Ce-ReV與MSC外泌體融合增強治療效果

考慮到一些病情較重的結腸炎患者遭受組織損傷，作者猜測有可能通過將生物因子納入Ce-ReV以增加組織修復功能來進一步增強治療效果。鑒于從間充質干細胞制備的外泌體含有多種生長因子的報道，作者設想Ce-ReV與MSC外泌體的融合可以實現上述目標（圖6a）。首先，作者從小鼠中提取骨髓間充質干細胞，并對其特性進行表征（圖S13a和b）。ReV與MSC衍生的外泌體融合后（圖S13c），作者進行激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）成像，以確認ReV和MSC衍生的外泌體重疊信號中存在雜交小泡（圖6b）。通過SDS-PAGE，可在ReMeV上鑒定這兩種類型囊泡的膜蛋白，表明囊泡雜交后大部分成分保留（圖S14a）。具體而言，Ce-ReMeV的Western Blotting證實Re存在膜標記熱休克蛋白70（HSP70）和TSG101，MSC衍生外泌體存在膜標記HSP70、TSG101、CD9和內因子肝細胞生長因子（HGF）（圖6c和S15）。

作者成功地在雜交膜上原位生長氧化鈰納米晶體，這可以通過高分辨率TEM和EDS元素分析進行驗證（圖6d和S14b）。晶體的尺寸小于3nm，Ce³⁺的比例仍然在60%左右，確保了高ROS清除活性（圖6e）。在成功構建Ce-ReMeV后，作者進一步測試了Ce-ReMeV和Ce-ReV對5%DSS誘導的嚴重結腸炎小鼠模型的治療潛力。實驗設計與3%DSS誘導模型相似，只是由于結腸炎的迅速惡化，對體重進行了7天的觀察（圖6f）。與觀察期內體重迅速下降且死亡率為37.5%的PBS治療組相比，Ce-ReV和Ce-ReMeV治療組體重均下降，且兩組均無死亡（圖6g）。值得注意的是，Ce-ReMeV治療組的小鼠比Ce-ReV治療組的小鼠體重減輕較少，這表明與MSC衍生的外泌體雜交具有一定的治療益處。因此，與健康小鼠相比，PBS處理小鼠的結腸長度顯著減少，而Ce-ReMeV處理小鼠的結腸長度僅略有減少（1cm）（圖6h和S16a）。

為了更好地理解Ce-MeReV對嚴重結腸炎進一步改善治療效果的潛在機制，作者繼續研究ROS和炎癥的作用。Ce-ReV治療組ROS水平降低，炎癥細胞因子水平受到抑制，與Ce-ReV治療組相比，Ce-ReMeV治療可獲得更好的結果（圖6i、j和S16b）。在組織修復方面，HE染色顯示Ce-ReMeV通過減少隱窩缺失而優于Ce-ReV，導致結腸損傷評分更低（圖6k和S16c）。Ce-ReMeV組如此良好的組織修復效果應歸功于氧化鈰納米晶體清除活性氧和MSC外泌體生物因子的協同作用。鑒于嚴重結腸炎導致微生物群失衡，作者檢查了Ce-ReMeV治療是否調節了結腸炎小鼠腸道微生物群的組成。通過對V4區域的16S核糖體RNA（rRNA）基因測序對糞便樣本進行分析表明，與其他治療組相比，Ce-ReMeV處理顯著提高了結腸炎小鼠的細菌豐富度，包括OTU豐富度、Chao1多樣性指數、香農多樣性指數和辛普森多樣性指數（圖6l，m）。進一步的家族水平分析表明，Ce-ReMeV處理顯著增加了鼠桿菌科、普雷沃菌科和類桿菌科的相對豐度（圖6n和S16d）。因此，這些結果證明了紅細胞囊泡與MSC外泌體結合的概念，并證明了Ce-ReMeV對具有廣泛組織損傷的極嚴重結腸炎模型的良好治療效果。

為了將作者的研究范圍擴大到結腸炎之外，作者招募了ALI患者進行腹部超聲分析（圖7a）。彩色多普勒超聲數據顯示，與健康志愿者（n=37）相比，ALI患者（n=34）的門靜脈血流速度顯著增加（增加1.35倍）。與健康小鼠相比，ALI小鼠的血流量增加了1.45倍，觀察到了類似的結果（圖7b、c和S17）。為了研究血管內皮的潛在破壞，作者對小鼠實施an le死，并使用掃描電鏡觀察固定的肝組織（圖7d）。與血管屏障完整的健康組相比，ALI組顯示出血管內皮完整性的破壞，血管屏障處的缺陷擴大就是例證。這些結果表明，炎癥肝組織中存在血流速度增加和血管完整性破壞，這促使作者使用Ce-ReMeV治療ALI。

接下來，作者使用ALI小鼠模型來評估Ce-ReV和Ce-ReMeV的治療效果（圖7e）。在24小時內每小時監測小鼠存活情況，結果顯示PBS治療組8只ALI小鼠中有6只死亡。Ce-ReV治療后，死亡小鼠數量減少到3只，這一情況得到改善。正如預期的那樣，Ce-ReMeV治療進一步提高了存活率，9小時時僅有一只小鼠死亡（圖7f）。在使用雙光子顯微鏡進行活體成像后，作者觀察到存活數據與肝組織中的ROS水平高度相關（圖7g）。與出現活性氧大量產生的PBS治療組相比，Ce-ReV治療組的活性氧水平明顯降低，Ce-ReMeV治療可進一步降低活性氧水平，接近健康對照組的水平（圖7h）。

為了評估抗炎反應，轉基因IFN-γ生物發光報告小鼠用于體內炎癥成像。PBS治療組的ALI小鼠在其腹部顯示出強烈的生物發光信號。相反，Ce-ReV治療的ALI小鼠腹部生物發光降低（圖7i和S18），而Ce-ReMeV治療組的信號強度被抑制到與健康對照組相似的水平。此外，使用ELISA分析受損肝組織的提取物（圖7j），作者發現Ce-ReV和Ce-ReMeV治療組的促炎細胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）和MPO水平降低。肝組織H&E染色顯示PBS處理的ALI小鼠有嚴重出血，而Ce-ReV處理的ALI小鼠肝切片的組織損傷程度明顯降低，Ce-ReMeV處理組幾乎沒有異常（圖7k）。通過顯著抑制兩種典型的肝功能血清標志物丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST），進一步證實了這種增強的治療效果，表明Ce-ReMeV治療的小鼠顯著抑制了這兩種標志物的水平（圖7l）。此外，肝組織的TUNEL染色顯示PBS處理的小鼠有明顯的組織凋亡，而Ce-ReV和Ce-ReMeV處理的肝組織的凋亡率有下降趨勢（圖S19）。這些急性肝損傷患者的臨床發現和ALI模型的實驗結果擴展了作者在結腸炎研究中關于Ce-ReMeV治療效用的發現，并證明了對炎癥性肝病的發展具有強大的保護作用。