靶向FGFR3胞外區域的人scFv抗體的篩選和活性研究

成纖維細胞生長因子(FGF)是最大的一類中胚層和上皮細胞生長分化多肽因子家族。FGFs在許多生物學過程中發揮重要作用，比如胚胎發育，傷口愈合，血細胞生成及血管發生等。此外，已有研究表明FGFs可以增加多種腫瘤細胞的浸潤性，如前列腺、膀胱、腎臟、乳房、胰腺等部位腫瘤。

目前，共發現20多種FGFs，對不同類型細胞具有不同的作用。但是，只發現了5種FGF受體(FGFR)。在蛋白水平上，這些受體具有55%-72%的同源性。FGFR結構包括一個胞外配體結合區域，一個跨膜區域以及一個胞內激酶區域。配體結合區域包含三個不同的類似免疫球蛋白結構域(稱為免疫球蛋白I，II和III)。FGFR1-3 mRNA的不同的剪接作用形成兩種亞型α和β。其中FGFR3具有兩種不同的突變體IIIb和IIIc。這兩種變體具有不同的親和活性：IIIc分布更加廣泛，能和多種FGFs結合(FGF1，FGF2，FGF4，和FGF9)；IIIb優先和FGF1結合，能夠較低程度和FGF8和FGF9結合。在有肝素(heparin)作用的情況下，FGFs和FGFRs結合后，FGFs誘導受體二聚化，引起胞內激酶區域的自身磷酸化以及下游信號級聯反應的激活。配體受體結合后，FGFs會啟動多種信號轉導途徑：胞內鈣離子水平升高，誘導絲裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C通路，激活腺苷酸環化酶以及誘導原癌基因c-myc 和c- fos。

已發現FGFR3會發生特殊突變，導致其酪氨酸激酶活性激活，引起一些與骨骼發育，多發性骨髓瘤，頸部腫瘤以及膀胱腫瘤相關的綜合征。最近的研究發現FGFR信號是前列腺腫瘤細胞在體外存活所完全必需的。近來，FGFR3已被作為多發性骨髓瘤的可能治療性靶點。盡管已有確實證據表明激活的FGFR3突變存在于腫瘤組織中，但是關于FGFR3在腫瘤組織中的表達知道的非常少。近來，使用基因芯片技術對基因表達分析后，發現和正常組織相比FGFR3在膀胱腫瘤樣品中過表達?；虮磉_水平通過Western blot和免疫組化分析在蛋白水平上進一步確證。事實上，這種蛋白的過量產生在過渡性腫瘤中似乎比基因突變更容易發生。所有這些數據都表明FGFR3可能是一個非常有吸引力的泌尿外科腫瘤的治療性靶點。膀胱腫瘤是生殖泌尿系統第二個最常見的惡性腫瘤之一。大約40%-50%的膀胱腫瘤表現出FGFR3基因發生突變；表皮腫瘤發生的概率(80%)比浸潤性腫瘤更大。

隨著人們對FGFR3作為不同腫瘤治療性靶點的興趣越來越大，以及進來發現它在過渡細胞瘤中的過度表達，我們已開始使用噬菌體展示技術開發用于治療的人源抗體。噬菌體抗體展示是目前最好的一個開發用于研究，臨床以及治療用途人源抗體的方法。但是，對于抗體開發來說，FGFR3分子非常難以琢磨，因為小鼠和人的FGFR3同源性非常高(92%)。僅最近，有報道通過使用一個庫容非常大(2.1*1010)的商業化Fab庫，開發出針對一個FGFR3亞型的Fab片段。在我們的試驗中，我們使用了兩個公開的scFv抗體庫Tomlinson I + J (MRCGeneservices, Cambridge, United Kingdom)。兩個庫的庫容都大概在1.4*108。scFvs相比IgG以及Fabs具有更好的腫瘤浸潤性，能夠更快速被清除，同時具有更好的特異性。在這篇報道中，我們已經篩選出了一些對FGFR3a的亞型IIIc具有特異性的人scFv抗體。這些抗體通過FACS證明可以和膀胱腫瘤細胞系RT112發生反應，并且抑制細胞增殖，具有進一步用于治療的潛力。

材料和方法

細胞系、蛋白、抗體：

RT112，HEK293；重組人FGFR3a（IIIc）/Fc，FGFR1a（IIIc）/Fc，FGF9，FGF1以及表皮生長因子。鼠抗人FGFR3單克隆抗體，羊抗人IgG（Fc特異性），鼠抗c-myc單克隆抗體，微管蛋白抑制劑；HRP-抗c-myc抗體，抗6His抗體，抗M13抗體，HRP-抗M13單克隆抗體，FITC-兔抗鼠IgG，R-藻紅蛋白羊抗鼠IgG，鼠IgG TrueBlot。

FGFR3 cDNA克隆和細胞轉染

FGFR3的胞外區域和人IgG的Fc C端融合表達，構建表達載體pcDNA3.1-FGFR3(IIIc)WT-Fc和pcDNA3.1-FGFR3(IIIc)S249C-Fc。然后，轉染HEK293T細胞。免疫印跡法和FACS檢測蛋白表達和活性。

從噬菌體庫篩選FGFR3特異性scFv抗體

人scFv噬菌體庫Tomlin-son I + J，輔助噬菌體KM13，E.coli TG1和HB2151。分別單獨培養兩個噬菌體庫，然后1:1混合噬菌體用于篩選。按照示意圖1所示，進行噬菌體庫篩選和scFv表達。第一輪篩選，使用1ug FGFR3或人IgG蛋白包被微孔板。噬菌體先和人IgG孵育1小時去除可以和Fc發生反應的噬菌體；再和FGFR3包被的孔孵育2小時。最后，微孔板使用0.1%PBST洗滌10遍(下一輪篩選洗滌20遍)，使用100ul胰蛋白酶處理微孔板，洗脫結合的噬菌體。洗脫獲得的噬菌體按照Goletz等描述的方法進行另一輪的淘選。

圖1：噬菌體庫篩選FGFR3特異性scFv抗體流程圖

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噬菌體ELISA

使用0.3ug的FGFR3，FGFR1或者人IgG蛋白包被微孔板，洗滌，封閉，加入不同濃度前面篩選純化后的噬菌體懸浮液。孵育后，加入HRP-抗M13抗體，加入底物顯色，450nm讀取結果。

單克隆噬菌體ELISA

經過兩輪或三輪的篩選后收獲的噬菌體經過培養生長出克隆，然后使用QPix高通量自動化克隆篩選系統(Molecular Devices)挑取單克隆到含有100ul 2TY培養基的96微孔板，37度培養，第二天使用相同培養基對培養物1:100稀釋，然后37度震蕩培養2小時，加入25ul含有109輔助噬菌體KM13的2TY培養基，繼續培養1小時。菌體經過離心，重懸于2TY培養基，30度過夜培養。最后，離心，取50ul上清，進行單克隆噬菌體ELISA分析。

可溶性scFv抗體的表達純化和ELISA檢測

獲得的高特異性克隆，使用E.coli HB2151誘導表達，離心收獲菌體，提取細菌周質腔蛋白，最后使用親和色譜純化。純化的各組分使用SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色分析。純化的組分進一步使用分子篩層析分離出scFv蛋白的單體(scFv容易發生二聚體或者多聚體)。

表面等離子體共振分析

使用BiacoreX分析可溶性scFv和FGFR3的結合動力學，并且計算獲得每個純化的scFv的Kd值；使用競爭性結合分析確定每個scFv的特異性結合位點。使用同樣的方法分析scFvs和FGF9，FGF1以及EGF是否能競爭結合FGFR3。

流式細胞儀和共聚焦顯微鏡分析

使用流失細胞儀分析噬菌體scFv和純化后可溶性scFv在細胞水平上和FGFR3的結合活性。通過處理RT112細胞，然后使用共聚焦顯微鏡進一步分析抗體結合活性。

細胞增殖分析

使用不同濃度的抗FGFR3 scFvs抗體(0.02-2umol/L)處理RT-112細胞，48小時后，使用MTT對細胞進行染色，然后570nm讀數。細胞活力通過下面公式計算：Abs-scFv處理的細胞/Abs-對照組細胞。

結果

篩選FGFR3特異性scFv抗體：如表1所示，總共隨機挑選了288個克隆，通過ELISA檢測，獲得15個FGFR3特異性的抗體克隆。通過測序發現，15個克隆里面有6個克隆的序列是唯一的。3A和1D序列內部有一個終止密碼子，只在VL的CDR2區有一個堿基突變。其他4個克隆的序列有比較大的區別，主要區別集中在CDR2和CDR3。其中CDR3在VH和VL都是高度可變的，CDR2的突變主要集中在VH。

ELISA