?總膜和質膜提取試劑盒利用離心管柱**技術可以分離出天然的膜蛋白，其原理是細胞/組織通過Buffer A 致敏，然后細胞以Z 字形路徑通過離心管柱，在這個過程中細胞膜會破裂，分離出完整的核,因此最終獲得的膜蛋白中不含有核膜和核蛋白污染。通過差速離心和密度離心（無需超速離心）把細胞蛋白分為：細胞核，細胞質，細胞器及質膜。細胞高速離心通過具有 Z 字形通路的離心管柱時細胞膜會破裂，所以本試劑盒無需勻漿。勻漿在分離細胞膜實驗中的主要問題是每次勻漿的過程中蛋白質圖譜都會發生變化，因此導致最終質膜的純度有顯著變化（實驗間差異）。相比而言，我們的試劑盒只要每次實驗使用同樣起始樣品量，設定固定的離心力和離心時間，即可獲得一致性更好的結果。整個操作過程在 45 分鐘內可以完成。
應用：
本試劑盒可以從細胞或者組織樣品中快速分離天然膜蛋白，可應用于 SDS-PAGE，immunoblottings，ELISA，IP， 膜蛋白質結構分析，2-D，酶活性測定及其他應用。
試劑盒組份：
- 25 ml?裂解液A
- 10 ml?裂解液 B
- 50?個離心管柱
- 50?個收集管
- 2 根塑料研磨棒
- 組織分離粉
- 儲存：
-20℃儲存
所需附加材料
1XPBS
渦旋震蕩儀臺式離心機
重要產品信息
- 仔細閱讀整個操作說明。將緩沖液A?和緩沖液B?完全解凍后搖勻，放置于冰上。將離心管柱和接收管套管放置于冰上預冷。
- 離心機請調整成 RCF?模式，所有離心步驟都需要在 4℃室溫下或者低溫離心機中進行。
- 研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制劑應在使用前加入緩沖液 A?中。蛋白酶抑制劑可以選擇添加或不添加，如添加在使用前加入緩沖液 A?中（請按照蛋白酶或磷酸酶抑制劑母液比例，例如母液是 100x，添加時按照 1： 100 添加，1ml?緩沖液A?添加 10ul?抑制劑）。
- 推薦使用BCA?方法測定蛋白濃度。
- 研磨方式請按說明書來操作，請勿使用液氮研磨。
膜蛋白分離步驟
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- 總膜蛋白分離
- 將離心管柱及接收管套管放置冰上預冷
- 總膜蛋白分離
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- 細胞樣品，低速離心（500-600Xg，5?分鐘）收集 1-50?X?106?個細胞。接轉 3a 步驟。組織樣品， 接轉 3b?步驟。（貼壁細胞樣品建議使用細胞刮刀收集，盡量不使用胰酶消化）
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注意：從細胞樣品中分離質膜蛋白，建議細胞量為 20-50 X 106 個細胞。
3a. 用預冷的 PBS 清洗一次細胞。去除上清，在 Buffer A 中重懸細胞（起始細胞數小于 5X 106 加入 200ul Buffer A，起始細胞數大于 5X?106?加入 500ul Buffer A）。冰上孵育 5-10 分鐘。渦旋大力震蕩 10-30 秒。迅速將細胞懸液轉入離心管柱中。接轉步驟 4.
3b. 組織樣品，將新鮮組織（10-30mg）或冷凍組織（20-30mg）放置于離心管柱上。加入 200ul Buffer A，用塑料棒反復扭轉研磨組織 1 分鐘（注意：如果你的樣品是骨骼或是心肌，建議在研磨前加入 100-200mg 組織分離粉）。再加入 300ul Buffer A，用吸頭吹打幾次后，開蓋冰上孵育 5 分鐘。接轉步驟 4.
注意：存在少量的非均質組織不會影響樣品的質量。塑料棒可重復使用。用 75%酒精擦拭或用蒸
餾水沖洗干凈。
- 蓋上蓋子， 16,000Xg，離心 30?秒。（此步驟推薦使用可在 10S?內達到離心力的臺式離心機，離心機的離心力和升速時間會影響膜蛋白得率）
優化：細胞樣品建議第 4 步完成后再次重懸細胞，轉移回離心管柱中，16,000Xg 再次離心 30 秒， 重復此步驟可以增加 20-30%產量。
- 棄去離心管柱，渦旋大力震蕩 10 秒重懸細胞。
以下步驟將細胞分為四組分：細胞核、細胞質、細胞器和質膜。
6.700Xg，離心 1 分鐘（沉淀是完整的細胞核）。將上清轉移到新的 1.5ml 離心管中，4℃，16000Xg 離心 10-30 分鐘（延長離心時間可以增加產量），棄去上清（上清為胞漿組份），保存沉淀（沉淀為總膜蛋白組份包括細胞器和質膜）。如果不需要分離質膜做到此步驟即可，產量一般為 10-500ug/ 樣品?？蓪⒖偰そM份存儲于-70℃或者根據下游實驗選擇溶解液溶解。如果需要提取質膜，請不要冷凍總膜組份。分離質膜繼續第 7 步驟。
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- 質膜蛋白分離
- 加入 200ul?Buffer?B?用吸頭反復吹打或渦旋震蕩重懸總膜蛋白組份。4℃，7800Xg，離心 5?分鐘
（注意：如果最終質膜組份中含有細胞器膜污染，此步驟離心時間可增加到 20 分鐘提高純度，第一次使用建議按照說明書操作，無需調整離心時間）。沉淀部分為細胞器。
- 小心的將上清液轉移到新的 2.0ml?離心管中，加入 1.6ml?預冷的 PBS?混勻幾次(此步 1.6ml?PBS 用于調整溶液密度，不可減量)。16000Xg，離心 15-30?分鐘（延長離心時間可以增加產量）。棄去上清液，保存沉淀（沉淀為質膜蛋白）。產量一般為 10-300ug/樣品。質膜蛋白可以根據下游實驗需求用 20-200ul?含表面活劑的緩沖液溶解。推薦使用下表中 MinuteTM 系列溶解液溶解膜蛋白。做等電聚焦（2D?凝膠第一維）我們建議使用：7M?尿素/2M?硫脲/2%Chaps?和 20mM?DTT?(使用前將DTT?加入以上混合液中)。
- 推薦按照下游實驗應用選擇以下蛋白溶解液溶解膜蛋白
關于分離出的質膜蛋白評價
許多研究人員利用 WB 對分離的膜蛋白進行純度檢測。一些常用的“胞漿內參”不僅僅存在于胞漿。例如 actin(1), GAPDH?(2) 和 tubulin?(3)主要存在于胞漿但是他們也存在于質膜中。所以在某些細胞和組織的膜蛋白中可以檢測到這些內參的弱信號不足為奇。更多相關信息，請參閱以下出版物： - Gruenstein E., et al. (1975). Actin associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of cell Biology.?64:223-234.
- Terrasse R., et al. (2012). Human and pneumococcal cell surface glyceraldehydes -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins are both ligands of human C1q protein. J. Biol. Chem.?287:42620-42633.
- Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica et?BiophysicaActa.
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