Western Blot的成功之道
? 近些年來，蛋白質組學研究是生物領域比較熱門和研究廣泛的方向。而Western Blot實驗是研究蛋白組學的基本實驗操作。但是一個成功的Western Blot實驗結果需要注意很多細節。
? Western Blot即蛋白質免疫印跡實驗，利用抗原抗體特異性結合來檢測目的蛋白的表達量。蛋白質印跡法是由瑞士米歇爾弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼爾·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化學》（Analytical Biochemistry）中首次被稱為Western Blot。蛋白免疫印跡（Western Blot）是將電泳分離后的細胞或組織中的蛋白質從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術，現已廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。
下面詳細介紹每一步的操作：
一、樣品的制備
? 樣本來源一般分為細胞和組織，常用的裂解液為RIPA（強）裂解液，需要加入適量的蛋白酶抑制劑。根據所收集的細胞沉淀多少或組織塊大小，加入適量的裂解液。根據說明書，冰上裂解10min或30min，定時進行渦旋震蕩。用BCA試劑盒進行蛋白定量，加入Loading Buffer于99℃的金屬浴上煮樣10min。
?加入的Loading Buffer目的
主要成分 | 主要功能 |
SDS | 使蛋白質變性并帶上負電荷 |
甘油 | 增加樣品密度，使樣品沉降 |
溴酚藍 | 離子型染料，可觀察蛋白的遷移 |
DTT | 減少二硫鍵的形成 |
二、凝膠電泳
* SDS凝膠配置原則：
先配置分離膠，再配置濃縮膠；
分子量越高，分離膠濃度越低；
根據上樣量選擇對應的玻璃板和梳子。
配膠成分表：
分離膠15% | 分離膠12% | 分離膠10% | 分離膠8% | 濃縮膠5% | |
總體積 | 10ml | 10ml | 10ml | 10ml | 5ml |
30%丙烯酰胺（29:1） | 5ml | 4ml | 3.3ml | 2.7ml | 0.83ml |
4XSDS-PAGE濃縮膠 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1.25ml |
4XSDS-PAGE分離膠 | 2.5ml | 2.5ml | 2.5ml | 2.5ml | 0 |
10%過硫酸銨 | 40ul | 40ul | 40ul | 40ul | 30ul |
TEMED | 4ul | 4ul | 4ul | 4ul | 3ul |
ddH2O | 2.4ml | 3.4ml | 4.1ml | 4.7ml | 2.84ml |
最佳分離范圍 | 10-40KD | 12-60KD |
配膠注意事項：
（1）清洗玻璃板：可以先用海綿擦清洗玻璃板，在用去離子水潤洗一次，可以放置于烘箱或通風廚中晾干。
（2）按照配膠表進行配置，充分混勻后在玻璃板中灌膠。
（3）加水或者醇類液封，速度要慢，防止將分離膠沖不勻或變形。
* 電泳
? ? 采用SDS-PAGE電泳，每孔上樣量可為20-50ng。在適當空內加入marker。先用80V電壓使樣品進行充分濃縮，到達分離膠后調為120V，當溴酚藍要跑出即可終止電泳，進行轉膜。
* 轉膜
? ?一般分為PVDF膜和NC膜，PVDF膜價格較貴，結合能力較強；NC膜價格便宜，結合能力較PVDF膜差，不能重復使用。
? ?PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量的蛋白結合就越牢固。大于20 kDa的蛋白選用0.45 um的膜，小于20 kDa的蛋白選用0.2 um的膜。PVDF膜在使用時需預處理，用甲醇激活15s，目的是活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電的蛋白結合（注意：不要有氣泡！不要將膠放干！原理：電場力作用條件下，PAGE膠中的帶負電荷的蛋白會發生定向遷移）。轉膜過程會產熱導致蛋白質降解，因此要使用冰袋散熱。目前市面上的快速轉膜液可以在常溫下400mA轉30min完成，方便快捷。
注意事項：
? 如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會短路，電流不會通過膠和慮紙。轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的，最后結束時一般是開始的 1.5-3 倍都是正常的。一般 Buffer 和濾紙選的對就不會短路。
轉膜方法：濕轉
轉膜后可以用麗春紅對膜進行染色，檢驗轉膜效率。
* 封閉
? 一般用5%的脫脂奶粉或者5%的BSA進行封閉。對于磷酸化或者生物素標記的抗體只能用5%的BSA。封閉是假為室溫1-2h。目的是去除非特異性結合。
* 一抗孵育
? 封閉后用TBST潤洗一次，然后根據蛋白的分子量大小進行裁膜，將對應的膜放入用一抗稀釋液配好的抗體中（具體稀釋比例要根據抗體說明書進行）。在4℃條件下置于搖床上孵育過夜。
* 洗膜
? 一抗孵育結束后，回收一抗，用TBST洗膜，每次7min，洗3次。
* 二抗孵育
? 洗膜結束后，加入配好的二抗（對應好一抗的種屬來源），室溫下置于搖床上1h，然后回收二抗，再次洗膜。
* 顯影
? 將PVDF膜洗干凈后，滴加ECL發光液，孵育1min左右，可進行顯影。
Western Blot可能遇到的問題：
無顯色信號問題的原因分析：
1．裂解產物中抗原含量不足；
a. 抗原無表達或表達量過少
b. 蛋白降解或上樣量不足
c. 裂解產物制備失誤
2．制膠濃度比例不合適；
3．轉膜不完全；
4．一抗稀釋濃度過大；
5．二抗與一抗不匹配；
6．顯色系統靈敏度不足
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非特意性雜帶出現的原因分析：
1．封閉或清洗不徹底；
2．一抗濃度過高；
3．蛋白降解；
4．抗體與非特異性蛋白交叉反應；
5．蛋白間聚集作用，形成二聚體；
6．轉移膜使用不當；
7．操作過程中轉移膜干燥
有一些污點的原因分析：
1．轉膜有氣泡；
2．孵育不均勻；
3．脫脂奶粉沒有充分溶解
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品牌 | 貨號 | 中文名 |
JSENB | ES427039 | 無水乙醇 |
JSENB | JS0039 | Tris?醋酸 |
JSENB | JS0332 | 無菌水 |
JSENB | JS0018 | 二羥乙基甘氨酸 |
JSENB | JS0030 | 甲叉雙丙烯酰胺 |
JSENB | JS0028 | 甘氨酸 |