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大鼠熱休克蛋白70(HSP70)ELISA試劑盒

原理

本實驗采用雙抗體夾心?ABC-ELISA法。用抗大鼠?HSP70?單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的?HSP70與單抗結合，加入生物素化的抗大鼠HSP70，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，HSP70濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中HSP70濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）

準備試劑與收集血樣

1.?收集標本：血清、血漿（EDTA）、細胞培養上清液、組織勻漿等裂解產物盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20?℃或-70?℃）保存，避免反復凍融。

2.?標準品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成80ng/ml的溶液。設標準管8管，第一管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在第一管中加入80ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。

3.?10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4.?洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

標本激活方法

??1.???將450ul標本稀釋液加入到一支1.5ml進口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標本。

?2.???加20ul?1?N?HCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60±?2分鐘。

?????3.???加20ul?1?N?NaOH,蓋緊，上下混勻。

?????4.???即用，或放-20/-70℃保存3天。計算結果時乘以稀釋倍數50。（注意：不同的標本HSP70的水平可能有較大差異，請根據實際情況靈活掌握稀釋度）

?????5.???細胞培養上清或組織勻漿10倍稀釋(410ul的標本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1N?HCI+20ul的1N?NaOH)。

檢測程序

1.?加樣：每孔各加入標準品或待測樣品（已激活）100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。

2.?洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。

3.?每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。

4.?洗板：同前。

5.?每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。

6.?洗板：同前。

7.?每孔加入底物工作液100ul，置37?℃暗處反應15分鐘。

8.?每孔加入100ul終止液混勻。

9.?30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。

結果計算與判斷

1.?所有OD值都應減除空白值后再行計算。

2.?以標準品8000、4000、2000、1000、500、250、125、0?pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。

3.?根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應HSP70含量，再乘上稀釋倍數即可。

試劑盒性能

??1.???靈敏度：最小的HSP70?檢測濃度小于65pg/ml。

2.?特異性：可同時檢測重組或天然的大鼠HSP70。不與大鼠其它細胞因子有交叉反應。

3.?重復性：板內、板見變異系數均小于12％。

注意事項

??1.???以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。

?2.???洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致精確度誤差及OD值錯誤地升高。

??3.???板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

??4.???本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

?5.???本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！