?植物游離脯氨酸（Pro）酶聯免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用???????目的：本試劑盒用于測定植物組織，細胞及其它相關樣本中植物游離脯氨酸（Pro）含量。

實驗原理：

???本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中植物游離脯氨酸（Pro）水平。用純化的植物游離脯氨酸（Pro）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入游離脯氨酸（Pro），再與HRP標記的游離脯氨酸（Pro）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的游離脯氨酸（Pro）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中游離脯氨酸（Pro）濃度。

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試劑盒組成：

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標本要求：?

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

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操作步驟：

1.?標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為600ng/L，400ng/L?，200ng/L，100ng/L，50ng/L）。

2.?加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.?溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.?配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

5.?洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6.?加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.?溫育：操作同3。

8.?洗滌：操作同5。

9.?顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μ