蛋白質(zhì)的分離純化
不同材料的預(yù)處理方法
關(guān)鍵詞：原核蛋白表達(dá)，原核表達(dá)，重組蛋白表達(dá)純化
摘要：本文介紹了在蛋白表達(dá)純化試驗(yàn)中，對(duì)不同來(lái)源的材料的預(yù)處理。主要從植物，動(dòng)物和微生物三種源材料的特點(diǎn)和注意事項(xiàng)進(jìn)行描述，并附有原核蛋白表達(dá)的案例。
蛋白質(zhì)在分子生物學(xué)中的分類，大體上可分為天然蛋白和重組蛋白。提取天然蛋白和構(gòu)建重組蛋白都需要先確定生物原材料，如植物材料主要以植物的葉，胚，果實(shí)和根莖等為主；動(dòng)物通常是選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的器官和組織；而微生物則是微生物菌體本身或發(fā)酵液。從原則上講，任何一種自然界中存在或不存在的蛋白質(zhì)都可以被外源表達(dá)出來(lái)，像原核蛋白表達(dá)就是以大腸桿菌（E.coli）為宿主菌表達(dá)克隆基因，在原核表達(dá)體系中，重組蛋白的含量比雜蛋白的含量高的多，所以選擇和設(shè)計(jì)合適的分離純化方案對(duì)于重組蛋白表達(dá)純化的下游實(shí)驗(yàn)就顯得尤為重要。
在提取和分離蛋白時(shí)有以下幾點(diǎn)需要注意：
1)?蛋白質(zhì)提取應(yīng)盡量多的提取出活性蛋白，避免各因素導(dǎo)致目的蛋白失活；
2)?選用不同的溶劑提取分離蛋白質(zhì)（大多數(shù)蛋白溶于水，稀鹽，稀酸等，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白則溶于乙醇等有機(jī)溶劑）；
3)?提取蛋白一般在低溫環(huán)境中操作，避免蛋白質(zhì)在提取過(guò)程中降解（可加入蛋白酶抑制劑，如PMSF、EDTA、antipain?和?leupeptin等）；
4)?提取時(shí)緩沖液的用量通常是原材料的1~5倍，提取時(shí)注意均勻攪拌，這樣有利于蛋白的溶解（緩沖液通常選用PH≈7,0.15mol/L磷酸鹽緩沖液或PH7.5,0.1mol/L?Tris-Hcl緩沖液）；
5)?蛋白質(zhì)提取常用各種水溶液，一般是在偏離等電點(diǎn)0.5pH以上，此時(shí)蛋白的溶解度增加；
6)?用稀酸提取等電點(diǎn)在堿性范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，用稀堿提取等電點(diǎn)在酸性范圍內(nèi)的蛋白，盡可能提高目的蛋白在提取液中的溶解度。
不同材料的處理
1.?植物材料的預(yù)處理
植物體內(nèi)通常存在著為數(shù)眾多的天然蛋白，提取時(shí)通常選用一些器官為主要原料。但植物提取蛋白時(shí)存在一些特殊問(wèn)題，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的得率較動(dòng)物和微生物的要低。
因?yàn)橹参锊牧现谐康牡鞍淄膺€含有大量的淀粉，纖維素和果膠等雜志，所以初步的均質(zhì)化處理需要在大量緩沖液中進(jìn)行，初步過(guò)濾后得到低濃度蛋白，之后需要進(jìn)行硫酸銨沉淀和PEG沉淀進(jìn)行分離，分離后的蛋白可與其他蛋白一樣，采用一般的蛋白純化處理。
2.?動(dòng)物材料的預(yù)處理
動(dòng)物原材料組織中含有豐富的目的蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)所處的不同位置（胞內(nèi)，胞外，亞細(xì)胞器等），應(yīng)選用不同的組織破碎方式。對(duì)于少量組織，可使用小型均質(zhì)器，大量組織則采用搗碎機(jī)快速搗碎方法。對(duì)于軟組織，可使用玻璃均質(zhì)器。組織均質(zhì)化后，將不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的蛋白酶釋放到溶液中，使之與目的蛋白接觸并降解，最后進(jìn)行純化處理。
注意：均質(zhì)化時(shí)間盡可能短，減少不必要的蛋白質(zhì)水解變性
在4℃預(yù)冷的緩沖液中進(jìn)行均質(zhì)化處理和后期分離操作，有助于降低蛋白質(zhì)水解
在緩沖液中添加蛋白酶抑制劑控制蛋白質(zhì)水解
3.?微生物材料的預(yù)處理
微生物可產(chǎn)生多種天然蛋白和重組蛋白，提取天然蛋白，首先要對(duì)大量菌株篩選獲得高產(chǎn)菌株，再進(jìn)行誘變育種分離產(chǎn)量更高的正突變菌株，最后通過(guò)基因工程技術(shù)提高內(nèi)源微生物蛋白產(chǎn)量。而重組蛋白的提取相對(duì)來(lái)說(shuō)就簡(jiǎn)單地多，微生物可以通過(guò)發(fā)酵的方式，短時(shí)間內(nèi)大量培養(yǎng)，從而分離出大量可純化的目的蛋白。與植物和動(dòng)物處理方法相比較，微生物蛋白通常比來(lái)源于植物和動(dòng)物的相同蛋白質(zhì)要更加穩(wěn)定，也更易于遺傳學(xué)操作。只要篩選出正確的培養(yǎng)條件，就可以獲得大量的特定蛋白質(zhì)菌體。
4.?細(xì)菌的裂解
細(xì)胞的破碎裂解是指用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械等方法破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，從而將胞內(nèi)物質(zhì)（目的蛋白）釋放到周圍環(huán)境的過(guò)程。針對(duì)不同用途和類型的細(xì)胞壁發(fā)展了多種方法，目前常用方法大體上可分為機(jī)械法和非機(jī)械法倆類，常用的機(jī)械破碎法有：高溫珠磨法；高壓勻漿；超聲破碎法。而非機(jī)械法包括滲透壓沖擊法；凍融破碎法；酶溶法；化學(xué)破碎法等。下面介紹在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛的酶溶法和超聲破碎法。
酶溶法
常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3?-葡聚糖酶；β-1,6?-葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要作用于細(xì)菌類，而其他幾種酶對(duì)酵母作用較為顯著。
主要步驟為：
① 4?℃，5000rpm?離心15?min，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（100?mL）。棄上清，每克濕菌內(nèi)加3?mL?
裂解緩沖液，懸浮沉淀；
② 沉淀稱量，每克菌內(nèi)加8mL?PMSF及80mL溶菌酶，攪拌20?min；邊攪拌邊每克菌加4?mg脫氧膽酸
（低溫中進(jìn)行）；
③ 37?℃，玻棒攪拌，至溶液粘稠時(shí)每克菌內(nèi)加20mL?DNase?I。室溫放置至溶液不再粘稠。
超聲破碎法
聲頻為?15-20?kHz?的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，在處理少量樣品時(shí)具有操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，節(jié)省時(shí)間，液體量損失較少等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還可對(duì)染色體DNA進(jìn)行剪切，降低液體的粘稠度。
主要步驟為：
① 收集?1?L?誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，40?℃?，5000r?pm?離心，15?min?；棄上清，每克濕菌加?3?mLTE?緩
沖液；
② 按超聲處理儀廠家提供的功能參數(shù)進(jìn)行破菌；10000g離心，15min，分別收集上清液和沉淀；
③ 分別取少量上清和沉淀，加入凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行SDS?-PAGE檢測(cè)。
注意事項(xiàng)：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度、菌種類型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標(biāo)本經(jīng)?3?-4?次凍溶后更容易破碎。
案例——從大腸桿菌中提取誘導(dǎo)表達(dá)的（His）6-X
簡(jiǎn)介：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，能夠獲得優(yōu)化的表達(dá)質(zhì)粒。而組氨酸標(biāo)簽（His）6是常用的重組蛋白純化
標(biāo)簽。
材料：感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)載體、LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素、IPTG、蛋白酶抑制劑、Ni-NTA親和層析柱、超聲波
破碎儀、高速冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、結(jié)合緩沖液（50mmol/L?Tris，PH7.9，500mmol/L?NaCl，5mmol/L?咪唑）、洗脫緩沖液（50mmol/L?Tris，PH7.9，500mmol/L?NaCl，500mmol/L?咪唑）
方法：
1)?采用RT-PCR擴(kuò)增得到目的基因X，構(gòu)建到表達(dá)載體上；
2)?用構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)轉(zhuǎn)化菌株，LB平板37℃培養(yǎng)過(guò)夜；
3)?LB平板上挑取一單菌接入5mL?LB培養(yǎng)基（100ug/mL?Amp），37℃培養(yǎng)3~5h；
4)?將5mL菌液接入1L?LB液體培養(yǎng)基中（100ug/mL?Amp），37℃培養(yǎng)至OD60≈0.6，加入0.3mmol/L的IPTG，16℃誘導(dǎo)16h；
5)?將培養(yǎng)好的菌液放入離心機(jī)中，5000r/min離心10min，棄去上清，收集菌體，離心后的菌體沉淀懸浮于25mL結(jié)合緩沖液中；
6)?將懸浮菌液裝在50mL玻璃燒杯中，加入適量蛋白抑制劑（10uL的10mg/mL?antipain），冰浴放置；
7)?超聲破碎，每個(gè)循環(huán)26次，超聲6s，間隔5s，根據(jù)破碎效果共2~4個(gè)循環(huán)，破碎后的菌體4℃?18000r/min?離心30min，上清液保持在4℃；
8)?Ni柱先用結(jié)合緩沖液平衡，然后上樣，結(jié)合30min后，每5~10min攪拌一次，靜置流干；
9)?用2~3倍柱體積結(jié)合緩沖液清洗非特異性結(jié)合蛋白，再加入15mL洗脫緩沖液洗脫，可分倆次加入以增加洗脫效率；
10)?SDS-PAGE檢測(cè)初步純化效果，進(jìn)行下一步純化步驟。
問(wèn)題分析及解決方案
1.?目的蛋白得不到可溶性表達(dá)或表達(dá)量很低
原核蛋白表達(dá)過(guò)程中，選擇構(gòu)建合適的表達(dá)載體需要考慮三個(gè)因素：表達(dá)載體、表達(dá)菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件。針對(duì)這三個(gè)方面對(duì)表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整，優(yōu)化表達(dá)條件；考慮更換不同的表達(dá)菌株（BL21、Rosetta、Origami?PLysS等）；表達(dá)載體可換成帶有其他有助于可溶性蛋白生成的標(biāo)簽載體（GST，MBP）。
2.?表達(dá)出來(lái)的蛋白易降解
首先要保證原核蛋白表達(dá)的操作過(guò)程處于低溫環(huán)境；操作過(guò)程中適當(dāng)?shù)?/span>補(bǔ)加一些蛋白酶抑制劑，盡量縮短提取時(shí)間；洗脫的目的蛋白溶液于4℃短暫保存，不易時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；注意超聲波的處理?xiàng)l件，判斷是否由超聲波處理過(guò)于劇烈而造成的降解。?
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