?細胞趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學趨向性）是趨向性的一種，指細胞、細菌及其他單細胞、多細胞生物依據環境中某些化學物質而趨向的運動。趨化性對細胞的發展和其他正常功能一樣不可或缺。EphA3在間充質細胞（eMSCs）中發現表達，但沒有在其他的血管連接組織有表達。澳大利亞的科研人員發現在人間充質細胞（MSCs）中表達的EphA3能夠在成人血管生成的早期發揮作用。在研究MSCs細胞對于血管生成的信號相應的實驗中，?研究人員使用過表達EphA3的MSCs處于EphA3的一個“興奮劑”IIIA4的一個穩定的濃度梯度中，可以觀測到過表達EphA3的MSCs對高濃度的IIIA4有負趨向行為。IIIA4是一個能使EphA3活化的抗體，研究表明IIIA4活化EphA3的MSCs減少了細胞間的聯系，從而推斷出EphA3對于MSCs的定位有著非常重要的作用。

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Hypoxia-Controlled?EphA3?Marks?a?Human?Endometrium-Derived?Multipotent?Mesenchymal?Stromal?Cell?that?Supports?Vascular?Growth

C.?To,?R.?Farnsworth,?M.?Vail,?C.?Chheang,?C.?Gargett,?C.?Murone,?C.?Llerena,?A.?Major,?A.?Scott?and?P.?Janes

PloS?one,?2014,?10.1371/journal.pone.0112106

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一.實驗材料準備：

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●?倒置顯微鏡，具有10X相差物鏡和定時拍照功能

●?鏡載加熱孵育系統（37℃，5%CO2）

●?可選配置：全自動載物臺，自動對焦系統

●?分析軟件：手動分析軟ImageJ的“Manual?Tracking”模塊和ibidi公司的“Chemotaxis?and?Migration?Tool”?進行數據統計分析。

●?EphA3+?eMSC?細胞

●?X-lkd?IIIA4抗體

●?細胞趨化載玻片（圖一）????????（ibidi）

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圖一，ibidi?細胞趨化載玻片圖示，如圖所示，細胞種在中間通道，兩邊的儲液池可以放不同的刺激因子，從中間通道的觀測可以得到細胞對刺激因子的趨向性，本例是使用一邊加入X-lkd?IIIA4抗體，另外一邊放入培養基作為實驗組，兩邊都放培養基作為對照組。?

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一.細胞趨化實驗

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1.實驗步驟

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●?將細胞直接加入ibidi細胞趨化載玻片的中間通道中（圖二）

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圖二，在觀測通道中加入細胞-基質膠混合液

●?將細胞趨化載玻片放入培養箱中30-35分鐘，等待細胞貼壁

●?細胞貼壁后分別在兩邊儲液池中加入60μl的X-lkd?IIIA4抗體和無化學趨化物培養基作為細胞趨化實驗（+/-）（圖三）

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圖三：加入X-lkd?IIIA4抗體（紅色）和無化學趨化物培養基（藍色）

●?在兩邊儲液池中均加入60μl的無化學趨化物培養基作為空白對照（-/-）（圖四）

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圖四：加入無化學趨化物培養基（藍色）作為空白對照

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●?按說明，將通道加液孔塞緊后可以進行圖像采集

●?將載玻片置入鏡載加熱孵育系統中，調整好采集位點，進行18小時的觀測，每20分鐘采集一張圖片

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一.圖像數據處理

1.手動細胞軌跡追蹤

●?下載ImageJ，并安裝Manual?Tracking模塊

●?導入采集的系列圖像到ImageJ中，打開模塊“Manual?Tracking”，選擇“Add?track”開始記錄細胞軌跡

●?選擇一個細胞，按照時間點單擊細胞，第一點擊后，會有新窗口跳出來顯示初始位置，以后每次點擊，都將在這個新窗口中產生一個該細胞隨著時間的新坐標

●?統計完足夠的細胞軌跡后，保存軌跡坐標表格

●?至少收集30個細胞的軌跡才具有統計學意義，避免同一細胞追蹤兩次，去除由于凋亡會而不能采集完整的軌跡的細胞

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2）全自動細胞軌跡追蹤

使用ibidi的WimTaxis自動分析平臺，將采集的系列圖像上傳到該平臺，幾個工作日后，會得到細胞軌跡的坐標表格數據結果。

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四、實驗結果：

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圖五：如圖所示，在沒有趨化因子存在時，細胞運動沒有趨向性，顯示出無序性。當X-lkd?IIIA4抗體存在時，細胞趨向遠離X-lkd?IIIA4抗體濃度高的區域。具有對X-lkd?IIIA4抗體的負趨向性。