?從微孔板檢測至Westerns定量：全面探索細胞熱應激反應
簡介
許多手段可以幫助研究者來探索細胞的各種反應過程，并且可從中獲得其大量的生物學信息，如細胞成像、基于細胞的活力檢測和增殖檢測等。Western Blot（即蛋白質免疫印跡法）不僅可用于觀察蛋白質表達情況的變化。通常情況下我們需要多臺儀器協同工作才能夠獲得足夠多的信息，當然整個過程我們也不得不需要掌握更多種不同的軟件。
此篇應用文章我們展示出如何僅利用一臺儀器，即SpectraMax? i3多功能檢測平臺就可以完成對許多細胞相應參數的收集和處理，我們用熱應激反應作例來展示不同檢測方式特點，包括成像和Western Blot功能，多重手段方便我們觀察細胞內不同反應過程帶來的不同變化。
眾所周知正常細胞長時間暴露在高溫環境下會引起細胞凋亡，同樣也會提高細胞HSP70（Heat Shock Protein）的表達量。我們將CHO-K1細胞置于兩種不同的生長環境下，即健康環境和壓力環境，首先將兩種環境下的細胞經過熱激處理以后，我們利用SpectraMax? i3多功能檢測平臺的細胞成像功能去檢測其細胞增殖、活力和凋亡的情況。我們也可利用ScanLaterTM Western Blot檢測系統獲得的數據經分析后發現，HSP70表達量與熱激反應成正相關性。
優勢
·???????? 無需任何染料分子即可以檢測細胞增殖
·???????? 熒光染料標記成像后可用于探究細胞死亡機制
·???????? 細胞成像，基于細胞功能實驗以及Western Blot檢測都可以通過同一平臺來實現
材料
·???????? CHO-K1細胞（ATCC P/N CCL-61）
·???????? 細胞培養基（Ham’s F12中加入10%胎牛血清和1%的雙抗）
·???????? 黑色，底透細胞培養微孔板（Corning P/N 3603）
·???????? SpectraMax i3微孔板讀板機
·???????? SpectraMax MinMaxTM 300細胞成像系統
·???????? EarlyTox Cell Integrity試劑（Molecular Devices P/N R8213）
·???????? CellEvent Caspase-3/7綠色檢測試劑（Life Technology P/N C10423）
·???????? ScanLater Westen Blot檢測系統
·???????? ScanLater抗鼠檢測試劑盒-銪元素標記羊抗鼠的二抗
·???????? ScanLater Western Blot檢測卡盒
·???????? 抗HSP-70鼠源單抗（R&D檢測系統P/N MAB1663）
·???????? Immobilon-FL膜， 0 . 4 5 μ m 孔徑（EMD Millipore P/N IPFL 00010）
方法
預先處理兩份CHO-K1細胞，分別將其處于健康環境和壓力環境。健康細胞為定期更換培養基而且傳代過程保證其匯合度不高于80%，然而壓力環境下的細胞不經常更換培養基且匯合度較高時才進行傳代處理。
進行熱激反應前一天，我們分別將健康環境下培養細胞和壓力環境下培養細胞鋪在黑色底透96孔板中，密度為7500細胞/孔，采用黑色底透的細胞培養微孔板的目的是便于細胞成像和細胞功能學實驗。針對于West e r n Blot樣品準備，預先以225,000細胞/每孔的密度鋪于6孔細胞培養板中。第二天，我們將一半的細胞進行熱激處理，即置于45°C環境下90分鐘，熱激處理后， 將細胞立刻放置于SpectraMax MiniMax 300細胞成像系統下，并利用其透射光通道觀察細胞形態的變化。經熱激反應6小時和24小時后，利用系統成像功能再次觀察 細胞形態學變化以及增殖情況。StainFree? 技術（免標記分析技術）無需染料分子既可以檢測每孔中細胞的數目。
利用細胞功能學實驗分析細胞凋亡和細胞活力情況，探索熱激反應能否誘導凋亡或者其他細胞死亡通路，觀察健康環境下培養的細胞和壓力環境下培養的細胞是否有不同的表現。CellEvent試劑用于熱激處理后細胞凋亡的檢測，Molecular Devices? EarlyToxTM Cell Integrity試劑盒可用于區分活細胞與死細胞。兩種檢測分別在其熱激反應后的第6小時和第24小時。
對于Western Blot檢測，細胞置于6孔板中進行培養，我們用胰酶消化細胞后，用含有0.5%Tween和蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液來清洗和溶解細胞，然后離心，上清液進行蛋白定量檢測，我們將2.1ug細胞提取物，上樣于4-20%濃度的膠中，然后再將蛋白轉移至PVDF膜上，一抗采用鼠源的抗HSP-70抗體，二抗采用銪元素標記抗鼠的二抗，我們利用SpectraMax i3檢測平臺組合ScanLater Western Blot檢測卡盒對蛋白條帶進行定量檢測。
細胞增殖
熱激反應后，在進行細胞成像和其他實驗前，我們先將細胞經過6小時和24小時恢復性生長。然后分別在這兩個時間點，利用StainFree技術在SpectraMax MiniMax300細胞成像系統上對細胞進行計數分析，無需染料既可以利用軟件優勢識別細胞并對其進行計數。利用SoftMax? Pro軟件中預置程序識別細胞，分析熱激反應后細胞增殖下降的情況，尤其是壓力環境下處理的細胞，觀察發現，24小時候后細胞增殖下降的情況更加明顯（圖一）。
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凋亡實驗
在6小時和24小時的兩個時間點，對細胞凋亡情況進行檢測，熱激反應的第6小時，壓力環境下的細胞凋亡百分率會更高，隨后第24小時我們發現壓力環境下培養的細胞其凋亡情況更加明顯（圖二）。比較后我們發現，未經過熱激處理的細胞比較穩定且凋亡細胞比率較低。
細胞活力實驗
利用EarlyTox Cell Integrity試劑盒來檢測細胞是否死亡，熱激反應后我們發現死亡細胞數目明顯增加，尤其是在第24小時后，壓力環境下的細胞比健康環境下的細胞死亡比率更高。這個結果與凋亡檢測結果相一致，可以說明全部或者大部分的細胞死亡結果是由于細胞凋亡所引起的。
HSP70誘導
Scanlater Western Blot分析后揭示的結果如預期，經熱激反應后HSP70誘導情況為在正常健康環境下處理的細胞的表達量更大。通過SoftMax 軟件和Scanlater系統，我們可以針對條帶強度進行定量分析，熱激反應6小時后健康環境下的細胞HSP70表達量增加了48倍，但是在壓力環境下其僅僅增加了1.5倍（圖四）。未經過熱激處理的壓力環境下細胞其HSP70表達量較健康環境下的細胞高出18倍。
結論
利用SpectraMax i3多功能檢測平臺的細胞成像和Western Blots功能來研究熱激處理后細胞的反應及變化情況。Stain-Free細胞計數功能來檢測正常及壓力細胞熱激后增殖情況的變化，細胞凋亡和活力實驗可以幫助我們了解熱激誘導細胞死亡的機制。最后，利用其Western Blot功能來定量檢測其熱激細胞和質控細胞（未經過熱激處理的細胞）誘導的HSP70含量。從細胞凋亡和細胞活力實驗結果，我們假設全部或者大部分細胞的死亡是由于熱激處理后引起的細胞凋亡。我們發現正常培養的細胞（無壓力環境培養的細胞）熱應激處理后誘導產生的HSP70量最高。而壓力環境下培養的細胞在進行熱激反應以前就已經表達HSP70，然后在熱激反應后會進一步提高HSP70表達量。
然而， 壓力環境培養下的細胞產生的HSP70量遠低于健康環境下培養的細胞，結果揭示出壓力環境下培養的細胞在凋亡過程中的保護機制要更低，所以可以觀察到細胞凋亡比率會更高。我們現在僅需利用 SpectraMax i3檢測平臺和SoftMax Pro分析軟件，就能夠采用多種方式來探究細胞功能，而傳統上實現這些檢測會需要多臺不同儀器和多款不同軟件的配合使用才能夠完成。