硫黃素 T 檢測

硫黃素 T (Thioflavin T) 是一種熒光染料，可以和富含β折疊的結構結合，例如α-突觸核蛋白纖維原、Tau 纖維原等。一旦結合，硫黃素 T 的發射光譜就會發生紅移 ，并且熒光強度會增強，這是一個很好的用來檢測纖維原形成的測試。以下操作指南是用α-突觸核蛋白前體纖維原和單體做的硫黃素 T 檢測。

1. 用蒸餾水制備 1 mM 硫黃素 T 儲備溶液 (新鮮制備并使用 0.2μm 注射器過濾器過濾)。

2. 用 PBS pH 7.4 稀釋硫黃素 T，確保每個孔中的硫黃素 T 最終濃度為 25 μM (每孔溶液體積= 100 μL). 孔板: Lumox 96 多孔孔板 (Sarstedt Catalog # 94.6000.024).

3. 在將要使用之前才把 alpha 突觸核蛋白小份在室溫下解凍。

4. 在相應的孔中加入 10 nM 前體纖維原或者 100 μM 單體 (或兩者都有). 用移液器將孔中液體上下吸入排出混合. 濃度為估計值，需要優化來得到好的信號，并避免浪費.

5. 密封孔板然后置于震蕩孵育器中 (600 rpm)，37°C 孵育.

6. 用 Molecular Devices Gemini XPS 微孔板讀板機讀取熒光讀數，使用軟件是 Softmax Pro 版本為 6.5.1.

XPS 酶標儀設置參數:

溫度: 37°C 讀取形式: 孔板掃描

波長: 激發光 450 nm，發射光 485 nm

PMT 增益: 自動

閃光每讀: 6

震蕩: 讀數前 20 秒

7. 再次密封孔板置于震蕩孵育器下 37°C.
8. 1 到 72 小時常規區間讀數.

細胞檢測
以下步驟是使用被活性和對照 alpha 突觸核蛋白前體纖維原 (PFFs) 處理的神經元獲取 ICC 圖片的實驗指南?；钚?alpha 突觸核蛋白 PFFs 處理的原代大鼠海馬體神經元顯示了路易體的內含形成，而經對照 alpha 突觸核蛋白處理的神經元沒有出現路易體形成。

1. 海馬體神經元取自出生一天的 Sprague Dawley 大鼠幼鼠，然后接種在 PDL 和層粘連蛋白包被的孔板上，每孔 80,000 個細胞。

2. 前體纖維原在水浴超聲波儀中處理 1 小時，然后馬上進行神經元處理。

3. 神經元用 4 μg/mL 的前體纖維原處理。對照孔中只有轉移媒介不含 alpha 突觸核蛋白。

4. 所有板孔 7 天后經過一個 50% 基液變化。

5. 基液變化 7 天之后（離體處理 14 天后），所有板孔用 4% 甲醛固定 20 分鐘。

6. 用過濾過的 10 mM PBS 洗掉甲醛，洗三次 (每次 10 分鐘)。

7. 用 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (LiCOR, 927-40010) 和 30 mL/mL 的 0.1% triton-X 100 固定細胞 30 分鐘。

8. 30 分鐘之后, 用 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (含 30 mL/mL 的 0.1% triton-X 100) 稀釋一抗，并加入到板孔中，4℃ 下過夜孵育。

9. 第二天, 用過濾過的 10 mM PBS 洗掉一抗溶液 ，洗三次 (每次 10 分鐘)。

10. 用 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (含 30 mL/mL 的 0.1% triton-X 100) 稀釋二抗，然后加入到板孔里黑暗中孵育 60 分鐘。

11. 60 分鐘過后, 用過濾過的 10 mM PBS 洗掉二抗溶液 ，洗三次 (每次 10 分鐘).

12. 用落射熒光顯微鏡 (Olympus IX73, B&B 顯微鏡) 20X 目鏡觀察孔板拍照.

13. 所有圖片都是在相同的比例和曝光時間下拍取的.

一抗: 抗-pSer129 復染色: Hoechst reagent 復染色稀釋度: 1:3000 復染色孵育時間: 1 hr

原代大鼠海馬體神經元 (DIV16) 被活性小鼠突觸核蛋白聚集體(SPR-324) 4 μg/ml (D-F) 處理后顯示路易體內含物的形成以及細胞減少，而當被對照突觸核蛋白聚集體(A-C)處理時沒有路易體內含物形成及細胞減少. 組織: 原代海馬體神經元. 物種: 斯普拉-道來氏大鼠. 固定: 由 PFA 制作的 3% 甲醛固定 20 分鐘. 阻斷: 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (LiCOR, 927-40010) 以及 30 mL/mL, 0.1% triton-X 100 阻斷 30 分鐘. 一抗: 小鼠抗 pSer129 抗體 (1:1000), 以及兔抗 pSer129 (1:800), 4°C下處理 24 小時. 二抗: ATTO 546 驢抗小鼠 (1:700) 和 ATTO 488 驢抗兔 (1:700) 室溫下孵育一小時 (復合圖綠色). 復染色: Hoechst (藍色) 細胞核染色, 1:3000 室溫下孵育 1 小時. 細胞定位: 路易體內含物. 放大倍數: 20x.

原代大鼠海馬體神經元被活性突觸核蛋白聚集體(SPR-322) 4 μg/ml (D-F) 處理后顯示路易體內含物的形成，而當被對照突觸核蛋白聚集體(SPR-317) 4 μg/ml (A-C)處理時沒有路易體內含物形成. 組織: 原代海馬體神經元. 物種: 斯普拉-道來氏大鼠. 固定: 由PFA制作的 4% 甲醛. 一抗: 小鼠抗 pSer129 抗體, 稀釋度 1:1000, 4°C下處理 24 小時. 二抗: FITC 羊抗小鼠 (綠色) 稀釋度 1:700 室溫下孵育 1 小時. 復染色: Hoechst (藍色) 細胞核染色, 1:4000 室溫下孵育 1 小時. 細胞定位: 路易體內含物. 放大倍數: 20x.