對于蛋白質表達非常低或未知的抗原靶標，可能需要在替代細胞系中使用重組蛋白或異源表達來進行抗體驗證。盡管內源系統由于更能代表體內條件而被優選，但重組策略提供了許多優勢。
重組策略的其他用途包括驗證和優化抗體在免疫沉淀中起作用的能力，并為蛋白質印跡應用生成標準的陽性對照。此外，通過提供表達各種略有不同的蛋白質形式的選擇，重組策略可以驗證針對位點特異性突變體的抗體特異性。
重組蛋白
重組蛋白的普遍用途是驗證抗體對一個或多個蛋白家族成員的特異性。為了說明這一點，圖 1 顯示了九種不同重組 PKC 同種型的蛋白質印跡分析，以確認 PKCδ (D10E2) Rabbit mAb 的特異性。在這種情況下，抗體結合是同種型特異的，對于其他測試的重組同種型沒有觀察到脫靶結合。
圖 2 以一種稍微不同的方法證明 14-3-3 (pan) antibody的泛反應性。蛋白質印跡數據清楚地顯示了對所有測試的六個重組同種型的抗體識別，為同種型反應性提供了支持證據。重要的是，加入上樣對照表明條帶強度的差異是由于蛋白上樣而不是由于抗體對不同同種型的親和力不同所致。
Figure 1
使用 PKCδ (D10E2)（上圖）或 GST (91G1)（下圖）對證實具有 PKCδ 特異性、細菌表達的、帶有 GST 標簽的純化 PKC 同工型進行蛋白質印跡分析。
Figure 2
使用 14-3-3 (pan)（上）或 GST (91G1)（下）對純化、重組、GST 標記的 14-3-3 同工型進行蛋白質印跡法分析，以表明具有同工型交叉反應性。
這里要注意的關鍵點是，盡管重組蛋白或肽段陣列可用于確定抗體特異性和交叉反應性，但是由于這些測定法的人工性質，這些類型的策略產生的結果可能會產生誤導。此外，這些系統的一些關鍵功能目前尚缺乏標準化，再次強調了需要用本手冊中概述的其他標志來支持任何重組策略。
異源表達
DNA質粒，被設計用于在異源系統中表達目標抗原靶標，是一種常見的重組蛋白法的替代方法。同樣，該策略通常用于驗證抗體特異性并確定與同工型、同源物和同源基因的交叉反應性。以這種方式表達的蛋白質易于通過已建立的技術進行分析，例如蛋白質印跡或免疫細胞化學染色。
若抗體針對表位標簽、在哺乳動物細胞中未內源表達的蛋白質或僅在一組有限條件下或在稀有細胞群中表達的蛋白質，異源表達是驗證此類抗體的必需步驟。由于無法在內源系統中分析這些靶標，因此異源表達對于驗證抗體特異性至關重要。
圖 3 顯示了使用 MAGE-A3 antibody 對 293T 細胞制備的裂解物進行的蛋白質印跡法分析，其中 293T 細胞用各種帶 Myc/DDK 標簽的 MAGE 同工型的表達載體進行了轉染。MAGE-A3 是一種在各種腫瘤細胞中經常表達的核蛋白，并且不被 293T 內源性表達。這些數據說明了對 MAGE-A3 的抗體特異性，其中 DYKDDDK 抗體用于證明成功轉染，而 β-Actin 抗體用作上樣對照。
在圖 4 中，數據顯示了對非天然表達蛋白 Cas9 的抗體驗證的數據，其模型與預期的實驗用途一致。在這里，將帶有 myc 標簽的 Cas9 轉染到 293T 細胞中，并使用 Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) mAb 進行檢測，以進行免疫細胞化學染色。使用 Myc-Tag（9B11）小鼠單克隆抗體確認 cDNA 的表達。
Figure 3
使用 MAGE-A3 (E9S4X)（上圖）、DYKDDDK Tag Antibody（中圖）和 β-Actin (D6A8)（下圖），對轉染空載 (-) 或轉染表達帶有 Myc/DDK 標簽的全長人 MAGE-A2 (hMAGE-A2-Myc/DDK)、帶有 Myc/DDK 標簽的全長人 MAGE-A3 (hMAGE-A3-Myc/DDK)、帶有 Myc/DDK 標簽的全長人 MAGE-A4 (hMAGE-A4-Myc/DDK)、帶有 Myc/DDK 標簽的全長人 MAGE-A6 (hMAGE-A6-Myc/DDK)、帶有 Myc/DDK 標簽的全長人 MAGE-A10 (hMAGE-A10-Myc/DDK) 以及帶有 Myc/DDK 標簽的全長人 MAGE-A12 (hMAGE-A12-Myc/DDK) 表達載體的 293T 細胞提取物進行蛋白印跡分析。
Figure 4
使用 Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H)（綠色）和 Myc-Tag (9B11)（紅色）對瞬時轉染帶有 myc 標簽的 Cas9（釀膿鏈球菌）表達載體的 293T 細胞進行共聚焦免疫熒光分析。綠色和紅色信號共定位在合成圖像（右下圖）中顯示為黃色。樣本用 ProLong? Gold Antifade Reagent with DAPI（藍色）封片。
研究位點特異突變體檢測
因為異源策略允許表達幾乎無限定的構建載體，它不限于表達野生型蛋白?？梢允褂迷诩毦虿溉閯游锛毎型庠?span lang="EN-US">/重組表達的蛋白質的位點特異性突變體來驗證位點特異性抗體的特異性。
圖 5 說明了這一概念，證明了phospho-p90RSK (Thr359) (D1E9) Rabbit mAb 對 p90RSK 蛋白的 Thr359 磷酸化形式的特異性。在這種情況下，除了 p90RSK 家族成員 RSK2 和 RSK3 上的等效位點之外，該抗體還用于探測從表達野生型蛋白、Thr359 至 Ala (T359A) 突變體、Ser362 至 Ala (S362A) 突變體或雙重突變體 (T359A/S362A) 的細胞制備的裂解物。
這些結果突出抗體的兩個重要特征：蘇氨酸位點的特異性和同等檢測其他家庭成員保守位點的能力。這些實驗很少進行或被大多數供應商忽視。
Figure 5
使用 Phospho-p90RSK (Thr359) (D1E9) 對模擬轉染 (mock) 或轉染了表達野生型 (WT) RSK1、RSK2 和 RSK3 或指定位點特異性突變構建體的 293T 細胞提取物進行蛋白質印跡分析，證明抗體與 RSK1 (Thr359)、RSK2 (Thr365) 和 RSK3 (Thr356) 的磷酸化特異反應性。
由于重組策略與其他標志性策略的明顯不同點在于它依賴于抗原靶標的非天然表達，因此將其與其他驗證策略結合使用以獲得關于抗體特異性和敏感性的有用認識至關重要。孤立地使用重組策略可能會產生誤導，但與其他標志性策略一起使用，它代表了一種非常強大的抗體驗證方法。