?血栓是心肌梗塞、腦卒中、肺栓塞、惡性腫瘤等多種疾病發展過程中血管內重要的病理事件。血栓由膠原、組織因子、凝血酶等因素觸發，誘導局部血小板活化、纖維/纖連蛋白復合物形成，這些關鍵成分共同參與構建包括腫瘤在內多種疾病的血管內微環境。因此，誘導或抑制不同疾病中的血栓組分，是納米藥物血管調控中的關鍵治療策略。
國家納米中心聶廣軍課題組利用仿生血小板納米顆粒實現血栓性疾病局部急性血栓的溶栓治療，相關工作于Advanced Materials上發表(Engineered Nanoplatelets for Targeted Delivery of Plasminogen Activators to Reverse Thrombus in Multiple Mouse Thrombosis Models)。作者針對目前血栓溶栓臨床一線用藥阿替普酶（rt-PA）出血風險高、治療時間窗窄、半衰期短的三個核心問題，提出利用血小板膜納米顆粒搭載溶栓藥物的策略。這種策略使得納米藥物制備簡便，并在小鼠腦卒中、肺栓塞、腸系膜血栓三個血栓性疾病模型上顯示出廣譜的優化溶栓治療效果。
?
?
?
基本信息
?
?
題目：
Engineered Nanoplatelets for Targeted Delivery of Plasminogen Activators to Reverse Thrombus in Multiple Mouse Thrombosis Models
期刊：Advanced Materials
影響因子：27.398
PMID：31788896
第一作者：徐俊超
通訊作者：
聶廣軍研究員、李素萍研究員與張銀龍博士
合作單位：
國家納米科學中心，首都醫科大學附屬天壇醫院、中國藥科大學、蘇州大學附屬第一醫院
索萊寶合作產品：
BC1375：Total Sulfhydryl（Mercapto）Assay Kit
C0030：Hoechst 33342
C0030：RIPA
?
?
?
研究背景及摘要
?
?
?
血栓性事件，即心血管相關疾病、缺血性中風和肺栓塞(PE)，是世界范圍內發病率和死亡率的主要因素。在血栓部位，急性血管阻塞可導致嚴重的組織損傷甚至器官衰竭，最終成為生命威脅。為了在緊急情況下實現血栓的快速清除和閉塞血管的再通，外科手術和溶栓治療通常是最有效的治療方法。由于外科手術的費用和侵襲性，溶栓藥物的應用，特別是FDA唯一批準的缺血性卒中溶栓藥物重組組織纖溶酶原激活劑(rt-PA)的應用，仍然是治療血栓相關疾病最重要的選擇。Rt-PA是血栓溶解的主要酶。這種酶催化血液纖溶酶原轉化為纖溶酶，進一步降解血栓的纖維網。雖然溶栓治療已被廣泛采用，但全身給藥會造成凝血因子的濫用，從而產生高風險的不良出血并發癥，如顱內出血。此外，大多數溶栓藥物半衰期短，需要在短時間內重復用藥，這會帶來額外的風險。考慮到這些風險，臨床指南通常建議在癥狀出現后3-12小時內應用溶栓治療。超過這個治療時間窗(TTW)，溶栓的益處將不再大于造成的出血風險。為了改善患者的預后，迫切需要針對性地將溶栓藥物輸送到局部血栓，以減少全身副作用，延長溶栓藥物的半衰期。
目前的溶栓策略由于治療藥物的半衰期短、靶向能力低和意外出血并發癥，而使得治療效果十分局限。受血小板在止血和病理血栓中的先天作用的啟發，作者開發了血小板膜偽裝聚合物納米粒子(納米血小板)，用于將溶栓藥物重組組織纖溶酶原激活劑(rt-PA)靶向遞送到局部血栓部位。量身定制的納米血小板可以有效地積聚在肺栓塞和腸系膜動脈血栓形成模型小鼠的血栓中，與游離rt-PA相比，溶栓活性顯著增強。此外，納米血小板在缺血性腦卒模型中表現出比游離rt-PA更好的治療效果。體內凝血指標分析表明，納米血小板具有較低的出血并發癥風險。作者所開發的復合仿生納米血小板為在血栓形成疾病中提高溶栓治療的療效和降低出血風險提供了一種有前途的解決方案，對改善血栓治療的現狀具有巨大的潛力。
?
?
?
?
研究內容及結果
?
?
1.?PNP-PA納米顆粒的制備及其表征
作者將血小板膜泡聚合物納米粒(PNP)與rt-PA(在下文中簡稱為“tPA”)結合，以實現血栓靶向溶栓治療(指定為PNP-PA；圖1a)。簡單地說，從小鼠全血中獲得的血小板膜被用來覆蓋PLGA核的外部。隨后，rt-PA通過-SH基團結合到血小板膜表面，形成PNP-PA(PMV，PMVs)。結果表明PNP-PA納米顆粒能夠在各種環境中成功合成，并且具有高穩定性。當靜脈注射到幾種不同的血栓動物模型中時，包括腸系膜動脈栓塞、PE和缺血性中風，PNP-PA均表現出強大的天然靶向性和局部血栓降解性能，表明該制劑在血栓相關疾病中具有廣泛的治療潛力(圖1b)。此外，安全性評估顯示由于PNP-PA為非系統性纖溶狀態而表現出比游離rt-PA更低的出血風險。這種仿生溶栓納米血小板為治療血栓相關疾病提供了一種安全實用的策略，并且引起出血并發癥的風險較低。采用血小板特異性標記物CD41和CD61對PNP-PA的表面免疫染色進一步說明了具有理想涂層取向的血小板膜的成功轉移(圖1c)。為了驗證合成過程是否影響膜蛋白的完整性，作者在基因本體注釋的基礎上，進行了蛋白質組學分析，對屬于不同細胞組分的蛋白質數量進行了分類。分析結果表明在制備PNP-PA過程中，高達81.3%的膜蛋白被保存(圖1d)而94.8%的細胞內蛋白質被去除(圖1e)。為了進一步證實功能膜蛋白在PNP-PA上的保留，作者進行了Western-blot分析。結果表明PNP-PA具有的主要膜粘附相關蛋白包括CD41、CD62p和CD61(圖1f)。
?
2.?PNP-PA的體外靶向性和溶栓作用
活化血小板是血栓形成的主要成分之一，尤其是在血栓形成的早期。作者采用流式細胞術分析PNP-PA與活化血小板結合。在流式細胞術實驗中，熒光標記的PNP-PA優先結合活化血小板(圖2a)。盡管PNP-PA與活化血小板結合，但PNP-PA本身并沒有顯示出任何活化血小板的能力。雖然活化血小板已被證實在使PNP-PA聚集在血栓形成部位過程中起關鍵作用，但活化血小板聚集分子的機制尚不清楚。作者認為，這可能是由于PNP-PA通過血小板膜上的多種特異性受體與血栓相互作用的結果。因此，PNP-PA能夠靶向血栓形成部位，進而實現rt-PA的功能。接下來，作者用激光掃描共聚焦顯微鏡評估了PNP-PA與血小板的結合能力。粘附的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)首先與純血小板孵育以模擬血管內環境中的血栓形成。然后，加入Cy5標記的PNP-PA或紅細胞膜包裹的納米顆粒(RNP-PA)并與血小板結合的HUVECs孵育。如圖2b所示，與RNP-PA組(Rr=0.378)相比，PNP-PA組顯示出更強的熒光強度和更高的血小板信號重疊共效率(Rr=0.866)。圖2c顯示，與Cy5.5標記的RNP-PA和游離Cy5.5相比，Cy5.5標記的PNP-PA能更有效地結合在患者血栓樣本上。以上實驗結果均表明，PNP-PA可以靶向血小板豐富的血栓。掃描電鏡觀察到PNP-PA在纖維蛋白網絡上的滯留，也表明PNP-PA在體外明顯粘附在富含血小板的血栓上(圖2d)。重要的是，凝塊密度和纖維蛋白的降低顯示了PNP-PA的溶栓作用(圖2d)。最后用共聚焦顯微鏡觀察PNP-PA的體外纖溶能力。綠色熒光標記的纖維蛋白網絡與生理鹽水、rt-PA、PNP、rt-PA、PNP-PA或RNP和RNP-PA孵育。圖2e，f中的熒光圖像和定量分析均顯示rt-PA、RNP-PA和PNP-PA均能在體外顯著降解富含纖維蛋白的血栓。
?
?3.?PNP-PA對PE小鼠模型的治療作用
急性肺栓塞(PE)是靜脈血栓栓塞后出現的的一種嚴重并發癥，死亡率高，30天生存率低于30%。在凝血酶誘導的PE小鼠模型中，作者觀察了PNP-PA對PE的治療作用。小鼠注射凝血酶30min后立即尾靜脈注射Cy5.5標記的PNP-PA或RNP-PA誘發PE。健康小鼠注射Cy5.5標記的PNP-PA作為陰性對照。兩小時后處死小鼠，采集心、肝、脾、肺、腎進行熒光成像。圖3a所示的結果表明，成功建立了PE模型，并且與RNP-PA相比，PNP-PA在PE小鼠肺中選擇性聚集。使用共焦顯微鏡觀察了肺冷凍切片中的PNP-PA信號。用血小板表面特異性標記CD41免疫熒光染色法觀察肺血栓內血小板。PNP-PA的熒光信號與CD41強共定位表明PNP-PA的血栓靶向性是由血小板膜相互作用介導的(圖3b)，然后使用磁共振成像(MRI)評估血栓搶救實驗中肺動脈的血流，正常小鼠肺動脈血流信號強，頸靜脈注射凝血酶后，血流信號明顯降低。然而，注射凝血酶后靜脈注射PNP-PA，信號幾乎完全恢復，表明PNP-PA有可能有效逆轉血栓栓塞(圖3c)。作者還評估了注射不同藥物制劑后PE小鼠的存活率。血栓誘導后，生理鹽水組的所有小鼠在6天內死亡，而游離rt-PA治療后將中位生存時間從4天提高到7天。值得注意的是，PNP-PA治療將中位生存時間進一步提高到14.5天(圖3d)。H&E染色顯示肺組織的血栓形成區結果也表明PNP-PA比游離rt-PA更有效地溶解血栓(圖3e，f)。
?
?4.?PNP-PA對腸系膜動脈血栓小鼠模型的治療作用
為了進一步驗證PNP-PA的血凝塊溶解潛能，作者建立了FeCl3誘導的血管內皮細胞損傷直接觸發的腸系膜動脈血栓小鼠模型。在FeCl3孵育之前，Rho6G標記的血小板靜脈注射到C57BL/6J小鼠體內，以觀察血栓。接下來，作者用熒光顯微鏡記錄血栓形成的動態過程。孵育20分鐘后，血栓完全形成。實時熒光顯微鏡分析表明，與RNP-PA治療組相比，PNP-PA和PNP對血栓的靶向性更強(圖4a，b)。但PNP-PA的熒光信號隨時間顯著降低，這可能與其纖溶功能有關。相反，RNP-PA組幾乎沒有熒光NP信號。接下來，作者比較了rt-PA、RNP-PA和PNP-PA組成的不同藥物制劑在腸系膜動脈血栓形成模型中的治療效果。當這些藥物在血栓完全形成前注射到小鼠體內時，rt-PA和PNP-PA能夠推遲血栓形成的過程(圖4c，d)，而在血栓完全形成過程中顯示出的作用是有限的，這與以前的報道一致。然而，如果這些藥物在FeCl3誘導血栓形成后作為延遲治療使用，當血栓完全形成時，只有PNP-PA治療能有效清除血栓；游離rt-PA沒有顯示任何明顯的治療效果(圖4e，f)。
?
?5.?PNP-PA對缺血性腦卒中小鼠模型的治療作用
靜脈注射組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)是FDA唯一批準的急性缺血性卒中溶栓治療方法。盡管新療法可能在一定程度上有助于減輕缺血性中風的長期副作用，但是患者從這些新一代療法中獲得的緊急益處仍然受到先前溶栓藥物的缺點的限制，即：半衰期極短、治療窗口窄、靶向性低，以及異常出血現象。作者為了探討納米血小板能否克服這些障礙，建立了短暫性大腦中動脈閉塞(MCAO)的栓塞模型。將MCAO小鼠隨機分為三組，分別靜脈注射生理鹽水、rt-PA或PNP-PA，另一組對照小鼠進行假MCAO手術。最后治療后，對小鼠進行神經功能缺損評估，以評估腦損傷程度。與生理鹽水組和rt-PA組相比，PNP-PA治療組的評分明顯較低，表明腦損傷較弱(圖5a)。在觀察的20天內，rt-PA治療使MCAO小鼠的存活率增加了20%左右，而PNP-PA治療使MCAO小鼠的存活率增加到70%(圖5b)。用2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)染色觀察治療后腦組織壞死區。PNP-PA組治療的MCAO小鼠的缺血面積明顯小于生理鹽水組或游離rt-PA組(圖5c)。缺血區的組織學檢查也顯示了同樣的現象(圖5d)；生理鹽水和游離rt-PA組出現了相當大的壞死，但PNP-PA組小鼠沒有。已知游離rt-PA通過多種途徑損傷血腦屏障(BBB)，進而引起神經毒性。免疫熒光染色結果顯示PNP-PA具有明顯的神經保護作用，如圖5e所示。?
6.?PNP-PA的藥代動力學及安全性評價
?
用Cy5.5標記的PNP-PA、RNP-PA或游離rt-PA對C57BL/6J小鼠進行體內實驗。在不同時間間隔采血，在熒光成像系統中檢測熒光強度。血漿藥代動力學參數如圖6a、b所示。PNP-PA、RNP-PA和游離rt-PA的半衰期分別為13.26、10.45和1.12 h，而藥物濃度-時間曲線的AUC(曲線下面積)分別為28.29、22.36和2.73，進一步證明仿生涂層延長了rt-PA的循環半衰期，并通過不同時間間隔的熒光成像檢測了Cy5.5標記的PNP-PA在器官中的分布。隨著時間的推移，肝臟熒光迅速降低，而腎臟熒光在最初的12小時內升高，然后在24小時后降低，反映了肝臟降解和腎臟消除的藥代動力學曲線。重要的是，在心臟、脾臟或肺中幾乎沒有觀察到熒光(圖6c、d)，表明在其他主要器官中幾乎沒有潛在的副作用。最后，作者對PNP-PA進行了體外和體內安全性評價。作者首先使用兩種非腫瘤內皮細胞系HUVECs和腦毛細血管內皮細胞(bEnd.3)研究了該制劑的體外細胞毒性。用PNP-PA處理后，即使在最大濃度20000 mg/L，HUVECs或bEnd.3均未觀察到明顯的細胞毒性。在體內，PNP-PA治療后的凝血參數、活化部分凝血活酶時間、纖維蛋白原時間、凝血酶原時間、凝血酶時間和出血時間與生理鹽水組相比無顯著性差異，游離rt-PA和RNP-PA治療導致這些參數的顯著變化，表明出血的風險很高(圖6e-i)。接下來，作者通過H&E染色研究了PNP-PA對心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟等主要器官組織病理學的影響，如圖6j所示，沒有明顯的病理變化。
?
?
研究結論
?
在本研究中，作者開發出一種新型的血小板膜修飾的納米粒子。PNP-PA能選擇性靶向血