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?基因敲除技術最新研究進展—|基因敲除技術|轉基因研究|基因克隆|基因靶向操作|

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基因敲除技術是建立在基因同源重組技術以及胚胎干細胞技術的基礎上而發展起來的一種分子生物學技術。1987年Thompsson建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型?。近年來新興起了ZFNs、TALENS、Cas9等多種基因高效靶向修飾和調控技術為主的基因敲除技術。2012年1月基因組編輯核酸酶技術的《Nature?Methods>雜志評選為年度研究方法，2012年12月被Science雜志評為2012年度十大科學進展之一。這些基因敲除技術極大地提高了基因敲除的效率，且具有極高的基因敲除特異性，為研究基因功能創造了新的途徑必將極大地推動生物學、醫學研究的發展。現常用的基因敲除技術主要包括以下幾類。

1?傳統基因敲除方法

1．1?利用同源重組進行基因敲除

基因敲除，又稱基因打靶，是一種遺傳工程技術，是在轉染細胞中發生外源打靶基因與核基因組目標基因之間的DNA同源重組，能夠使外源基因定點地整合到核基因組的特定位置上，從而通過基因敲除達到改變細胞遺傳特性的目的。傳統的基因敲除技術依賴于細胞內自然發生的同源染色體的隨機交換，但在體細胞內，基因同源重組的效率特別低，增加了基因敲除實際操作的工作量，限制了基因敲除技術的應用。而且，用單純的同源重組實現人類基因組的永久修復是不切實際的，這也嚴重阻礙了生物學研究的發展?。

1．2?利用隨機插入突變進行基因敲除

大規模的隨機插入突變理論上可實現在基因組范圍內對任一基因敲除。這項技術可提高基因敲除效率，使基因完全失活以及容易分離鑒定等優點。目前較為有效的基因敲除方法是隨機插入突變可以分為T-DNA插入突變和轉座子插入突變，兩者是在植物中使用廣泛的基因敲除手段。T-DNA插入失活技術可以直接在植物基因組DNA中產生穩定的插入突變，而且插入位點的隨機性較強，但是只適用于那些容易被T-DNA轉化的植物，且常常會引起染色體重排現象，使突變體表型與T-DNA插入無關而難以進行遺傳學分析。這種基因敲除方法在擬南芥中可產生35％?～40％的突變率，19％?的突變體具有外觀可察覺到的表型特征。近年這類基因敲除方法在擬南芥研究中應用廣泛?。

2?新興的基因敲除技術

2．1?利用RNA干擾引起的基因敲除

RNA干擾是RNA依賴的基因沉默現象，是雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘發的序列特異性的轉錄后基因表達沉默。dsRNA在Dicer酶的作用下可產生一系列長度為21～22?nt的siRNA，siRNA分子、核酸酶以及螺旋酶等結合形成RNA誘導沉默復合物，R1SC以ATP依賴的方式催化雙鏈siRNA解旋，利用RISC內部的單鏈siRNA，通過堿基配對識別與之互補的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，從而導致目的基因的沉默。因此，通過將dsRNA分子導人細胞內，特異性地降解細胞內與其同源的mRNA，封閉內源性基因的表達來失活該基因同樣可以實現基因敲除。

2．2?鋅指核酸酶基因打靶技術的基因敲除

鋅指核酸酶基因打靶技術的核心設計思想是將2個有特定功能的結構域，即特異性識別模塊和功能模塊融合，形成具有特定功能的蛋白。單個ZFN的DNA結合結構域一般包含3～6個Cys2一His2鋅指蛋白重復單位，能特異性識別1個三聯體堿基。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內切酶來自Fokl的c端的96個氨基酸殘基組成的DNA剪切域，每個Fokl單體與一個鋅指蛋門組相連構成一個ZFN，識別特定的位點，當2個識別位點相距6～8bp距離時，2個單體ZFN相互作用產生酶切功能。在此特異位點產生1個DNA雙鏈切口，然后利用細胞固有的同源重組或非同源末端連接修復機制進行切口修復，從而達到精確定點修飾的目的?。ZFN介導的基因敲除技術，可以精確地修飾基因或其周圍的調控元件，可為研究人類疾病構建良好的動物模型，通過原核注射或胞質注射獲得的基因敲除大鼠、基因敲除兔。存在同源區的外源DNA時，發生同源重組修復，能實現外源基因的定點敲入。

2．3?利用TALEN切割特定的核苷酸靶序列引起的基因敲除

TALENs靶向基因敲除技術是一種嶄新的分子生物學工具，被認為是基因敲除技術發展的里程碑。TALENs靶向基因敲除的設計和構建是基于植物病原體黃單胞菌分泌的一種轉錄激活子樣效應因子可以識別DNA序列的原理。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊蛋白。TAL蛋白中的DNA結合域與Fokl核酸內切酶的切割域融合，在特異的位點打斷目標基因，進而在該位點進行DNA操作，如基因敲入(Knock—in)、基因敲除(Knock—nut)或定點突變。

2．4?Cas9基因敲除技術

2013年初，一種全新的人工核酸內切酶clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats?(CRISPR/Cas9)出現,主要由細菌和古細菌通過一種不斷進化適應的免疫防御系統改造而成，II型CRISPR/Cas9免疫系統依賴Cas9內切酶家族靶向和剪切外源DNA,達到基因敲除目的。Cas9基因敲除技術的特點是制作簡單，成本低，作用高效?。CRISPR/Cas9將進一步靶向基因操縱推向高潮，使得多個基因敲除、敲入變得更為簡單、高效。作為一種新的基因編輯技術，CRISPR/Cas9有靶向精確性高、試驗周期短、無物種限制、具有好的活性等特點和優勢。不僅如此，CRISPR/Cas9基因敲除系統還可以同時針對同一細胞(Es)中的多個位點能實現多靶點同時酶切，人們運用該技術成功獲得斑馬魚等模式動物基因敲除模型，使得多個基因敲除、敲入成為可能。雖然目前對該技術的特異性及免疫原性了解甚少，但隨著研究的不斷深入，一定會有很大的改善。

盡管利用人工核酸酶ZFN、TALENs和細菌獲得性免疫系統CRISPR這類基因敲除技術目前還處于研究的初期階段，其在基因敲除方面已表現出巨大的潛力和廣闊的應用前景，被認為是靶向基因修飾的革新技術。由于這些新技術依然還有許多未知因素并沒有研究透徹，因此，在基因敲除技術方法的研究過程中，它們發揮的作用將不可限量。

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