| 巢式PCR具有很高的靈敏度和特異性，但傳統的巢式PCR采用兩對引物，通過兩輪PCR，進行目標產物的擴增。這種操作的不便性，使得其高靈敏度的特性難以應用到快速檢測和臨床診斷中。在單管巢式PCR的擴增中，由于內側引物會阻礙外側引物的擴增，因此標準的Taq DNA聚合酶不能在單管巢式PCR的擴增中，發揮其高靈敏度的特性。采用耐高溫、且具有鏈置換活性的聚合酶，可保證在單管反應中，內外兩側引物同時擴增，巢式PCR才能達到真正意義上的高靈敏度。一步法巢式PCR（One-Step Nested PCR）技術最早報道于2013年，雖然其擁有高靈敏度的檢測特性，但始終未能在核酸檢測領域獲得廣泛應用。其主要原因是SD聚合酶的鏈置換活性過于強烈，而導致外切酶活性作用的機會太弱，導致高信噪比的TaqMan探針無法應用于One-Step Nested PCR。因此，One-Step Nested PCR的熒光探針檢測只能依靠特異性和信噪比欠佳的發卡FRET探針。 憑借在分子工具酶改造工作中積累的的豐富經驗，開發出具有探針切割活性的SD 2.0 DNA Polymerase和SD 3.0 DNA/RNA Polymerase，結合獨有的P-Bond錨定探針技術，將高信噪比的TaqMan探針應用到One-Step Nested PCR上，建立起了TaqMan One-Step Nested qPCR方法。運用TaqMan One-Step Nested PCR方法檢測DNA或RNA分子，在檢測靈敏度和擴增速度方面，都是傳統TaqMan PCR法難以企及的。因此，TaqMan One-Step Nested PCR技術將是未來基因檢測市場爭奪戰中的最有利武器之一。 |
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| 一、One-Step Nested PCR 高靈敏度機理 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在標準PCR過程中，使用上游和下游兩條引物對靶基因進行熱循環擴增，每經過一個循環的擴增，產物最多變為2倍。而在One-Step Nested PCR(或稱為PCDR法，Polymerase Chain Displacement Reaction)的擴增中由于使用兩條上游引物和兩條下游引物，因此在每次熱循環過程中，產物增加近4倍，在經過30-40次循環后，核酸產物將會高于PCR法成千上萬倍，并且所需的循環數更少。在核酸檢測的實驗中，One-Step Nested PCR法比標準PCR法靈敏度要高10-100倍，并且更容易開發出高靈敏的檢測試劑盒。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 二、TaqMan One-Step Nested qPCR熒光法核酸檢測技術 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| TaqMan One-Step Nested qPCR技術是在PCDR的基礎上，研發團隊利用具有探針切割活性的SD2.0或SD3.0 DNA/RNA聚合酶，結合獨特的P-Bond探針錨定技術開發的一項新的核酸檢測技術。該技術較目前核酸檢測工作中常用的Taqman qPCR技術，在靈敏度和擴增速度上，具有極大的優勢，因此該技術在目前和未來的核酸檢測領域具有極大的推廣和應用價值。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 三、TaqMan One-Step Nested qPCR熒光法核酸檢測技術應用策略 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 在TaqMan One-Step Nested PCR的實驗中，采用4條擴增引物的情況下，檢測靈敏度和擴增速度較傳統TaqMan PCR法會大幅提高。同時，由于采用了4條擴增引物，當在檢測變異度較高的RNA病毒時，突變對擴增引物的影響顯著降低，從而避免了漏檢的可能性。當再增加一條檢測探針時，對突變的敏感度進一步降低，此時已經與TaqMan PCR的雙重檢測防止漏檢的設計完全相同，但One-Step Nested PCR法檢測靈敏度更高。為了進一步提高檢測靈敏度和擴增速度，可以再增加一對擴增引物，采用6引物進行擴增。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 圖：TaqMan One-Step Nested PCR引物和探針設計原理 |
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| 四、TaqMan One-Step Nested qPCR的引物和探針設計原則 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 五、TaqMan One-Step Nested PCR的擴增性能展示 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1.以非洲豬瘟DNA病毒核酸檢測為例，進行TaqMan One-Step Nested PCR與TaqMan PCR兩種方法性能的比較。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 2.以2019-CoV RNA病毒核酸檢測為例，應用TaqMan One-Step Nested PCR進行檢測。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 圖A:針對2019-CoV的N基因使用的引物、探針策略圖示 |
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| 3.TaqMan One-Step Nested PCR用于SNP或變異毒株的分型檢測。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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圖A:針對2019-CoV的S基因的D614G突變使用的引物、探針策略圖示 |
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