Illumina測序流程簡介，蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司提供，客服熱線：4006-400-850
二代測序也稱大規模平行測序。
主要平臺有3家：Illumina的HiSeq、MiSeq以及早期的GA；Roche的454；Life Technologies （即ABI，現ThermoFisher）的SOLiD、Ion Torrent和Ion Proton如今Roche已經停產。
簡單歸納，3家的原理如下：
Roche 454 FLX：Pyrosequencing（焦磷酸測序），檢測焦磷酸轉換成的熒光信號，emulsion PCR;
Illumina: Sequencing-by-synthesis （邊合成邊測序）with reversible terminators, bridge PCR;
ABI SOLiD: Sequencing by ligation（邊連接邊測序）, emulsion PCR;
Thermo Ion Torrent: Pyrosequencing（焦磷酸測序）, 檢測質子電位（pH值），emulsion PCR。
Illumina技術是所有二代測序技術路線中最簡便的，直奔目的，不繞彎子。因為簡單直接，所以穩定可靠，重復性強，數據質量高，錯誤率低。
illumina整個測序分4步：
核酸提取，文庫制備，簇生成，測序，數據分析。
上機前：核酸提取，文庫制備，簇生成。
上機后：測序及數據分析。
A核酸提取
樣本類型：培養的細胞、外周血、新鮮冷凍組織或石蠟包埋組織(FFPE)
提取核酸類型：DNA、總RNA或者小RNA
步驟：
樣本提取-純化-定量
標準流程需求：0.1-1ug DNA或RNA
試劑：提取及純化試劑盒
定量儀器: NanoDrop 顯示A260/280，可顯示純度
1標準流程2 低量流程（依自條件和經驗而定）
B 文庫構建
文庫制備的具體流程因樣本種類和測序目的的不同而不同，比如基因組DNA，轉錄組(mRNA)，microRNA, CHiP-Seq，外顯子捕獲測序等等，但是大同小異，基本過程是把長鏈DNA隨機打斷成短片段，兩端接上通用引物，再經過12循環左右的PCR把文庫放大。
基因組文庫構建步驟：
基因組DNA--350bp左右DN**段—barcode接頭序列—12循環左右文庫擴增片段化、連接、擴增“三板斧” 期間穿插進行一些純化、定量的輔助步驟。
1 片段化：
原則是斷點越隨機越好，片段長度越集中越好
方法：高壓氣體的霧化作用、超聲波的氣穴作用、普通超聲波、酶等手段、設備。
一般而言：
SR測序的模板長度約350堿基，PE測序的模板長度約500堿基，MP測序的模板長度約1k-10k堿基
超聲方法片段化后片段大小呈正態分布，通過瓊脂糖電泳割膠或者用不同緩沖液下磁珠純化方法來進一步收縮片段長度范圍，精選所需片段。
2末端修補
一般而言，末端修補要用到3種酶：5’端延伸的酶，5’端連接的酶，以及3’端延伸的酶。
3 3’端加A
目的：為了提高連接效率，也為了防止接頭與插入片段以多種方向連接，同時減少接頭之間的互聯，接頭與插入片段之間的連接采用TA半粘性末端的連接方式。
方法：接頭的3’端帶有一個突出的T堿基，插入片段的3’端帶有一個突出的A堿基。
4 兩端加接頭
目的：廠家提供的接頭都包含有序列已知的barcode區域，以方便測序完成后對數據進行拆分。這些接頭按barcode序列進行編號，所以在進行接頭連接這一步實驗操作的時候，要特別小心不要把barcode編號與樣本之間的對應關系搞錯。
另外，不同的應用，其接頭在序列和結構上都有可能不一樣。比如SR測序與PE測序，它們的接頭和flow cell都不一樣，不能混用。
5 連接產物純化
目的：選出完整的連接產物，去除殘缺不全的副產物
方法：割膠回收；磁珠純化
6 PCR富集
目的：增加文庫量，方便上級測序；提高完整片段文庫所占比例
注意：此步可省略，因為PCR會引入數據偏倚率，若不喜歡，可省略，稱為PCR-free
7 過柱 磁珠純化
8 文庫質檢
lAgilent 2100 Bioanalyzer：測定文庫片段長度及長度分布；
lQubit或其他設備：測定濃度；
l瓊脂糖凝膠電泳；
Qubit只取其測定的重量濃度(ng/uL)；2100只取其測定的文庫片段長度。二者結合，計算文庫的摩爾濃度；瓊脂糖凝膠電泳用于觀察文庫的整體情況，片段長度是否符合預期，片段長度分布情況，是否有雜帶，是否有引物二聚體或接頭二聚體殘留等等。如果有二聚體殘留，則進行純化。
結合三者數據，計算文庫摩爾濃度，將文庫統一稀釋到平臺要求的濃度
根據項目不同需要將文庫混合？？不同的barcode的文庫不要混合想，一旦混合，將無法分開
C ClusterGeneration
使用cbot儀器 高度自動化，無需人工干預，4小時
MiSeq、快速HiSeq 2500等少數幾種型號的測序儀上也能進行
步驟：文庫模板雜交、橋式PCR、線性化、末端封閉和測序引物雜交
FC（ flow cell）準備就緒后，可以拿到測序儀上真的開始測序了。
注意：cluster generation最好在測序前先進行。Cluster完成后，越快測序越好。
D上機測序