1. 背景描述：
相比較于傳統的生色法和化學發光法只能定性和半定量檢測一個蛋白的局限性，熒光WB不僅能在定性的同時實現蛋白定量，而且還兼容多色熒光抗體的優越性，同時完成二個或者更多蛋白的檢測。因此對熒光WB技術的發展是科研水平進步的必然需求。而熒光WB實驗技術的開展步伐也一直受檢測儀器和熒光染料開發限制?，F在這兩項技術已經逐步成熟。
A 熒光Western Blots與檢測儀器
目前應用最普遍的熒光WB成像儀是LI-COR Odyssey Infrared Imaging System（見下圖）。
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染料名稱 |
靈敏度 |
Odyssey通道 |
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IRDyeTM 800/ IRDyeTM 800CW |
+++ |
800 |
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IRDyeTM 700DX |
++ |
700 |
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Alexa Fluor? 680/ Dylight TM 680 |
+++ |
700 |
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Alexa Fluor? 700 |
++ |
700 |
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Alexa Fluor? 750 |
++ |
700/800(不推薦使用，雙通道都能檢測到信號) |
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Dylight TM 800/Alexa Fluor? 790 |
+++ |
800 |
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Cy? 5.5 |
++ |
700 |
B 熒光Western Blots與熒光染料
Alexa Fluor?是invitrogen公司的**產品，其下不同波長的產品是目前市場上口碑最高的熒光染料之一。Alexa Fluor? 680是一種遠紅外（far-red，紅外光譜中離紅色可見光最遠的光）發射染料，Ex= 684nm，Em=702nm。Alexa Fluor? 790是一種紅外(Infrared,波長范圍在750 nm~1 mm)發射染料，Ex= 783nm，Em=803nm（光譜見下）。
與標記常用可見光染料的抗體相比具有：更高靈敏性，更低熒光淬滅性；高消光系數和低自發熒光背景的特點。因此可用于更多的免疫熒光檢測和成像系統。Alexa Fluor? 680/790標記抗體的應用有：
·高靈敏度Western Blotting；·熒光定量Western Blotting； ·In-gel Western Blotting；
·MicroWestern arrays； ·In-cell Western arrays； ·On-cell Western arrays；
·Tissue section imaging； · small animal whole body imaging ；
2. Alexa Fluor? 680/790熒光抗體應用實例：
Jackson Immunoresearch提供Alexa Fluor? 680/790熒光染料標記的信號增強型一抗，親和純化二抗（單標/多標實驗），鏈霉親和素和IgG對照品。該類抗體標記具有很高的靈敏性，推薦抗體稀釋范圍為1:50,000-1:200,000。
圖片描述：
用Alexa Fluor? 680和Alexa Fluor? 790標記抗體進行免疫熒光Western blot實驗。檢測系統為LiCor Odyssey成像儀。其中，Mouse IgG和goat IgG用β巰基乙醇和SDS進行還原和變性，用SDS-PAGE電泳分離重鏈和輕鏈，電泳后轉移到NC膜上，用Alexa Fluor? 790-goat anti-mouse IgG, Fcγ Subclass 1 specific (min X Hu, Bov, Rb Sr Prot, 115-655-205)(稀釋比例1:100,000，綠色)檢測重鏈，并用Alex Fluor? 680-goat anti-mouse IgG, light chain specific (min X Bov, Gt, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Ig, 115-625-174)( 稀釋比例1:100,000，紅色)檢測輕鏈。Goat IgG用來作為背景對照，實驗中Goat IgG重鏈和輕鏈的微弱條帶表明即使稀釋比例為1:100,000，Alexa Fluor? 680和Alexa Fluor? 790染料仍具有亮度。
3. Alexa Fluor? 680/790常用熒光產品（更多請見官網）
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Streptavidin and Antibody Description 鏈霉親和素和抗體描述 |
Alexa Fluor?680 |
Alexa Fluor?790 |
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Streptavidin 鏈霉親和素 |
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Donkey Anti-Chicken IgY?(IgG)(H+L) 親和純化驢抗雞IgY(IgG)(H+L)二抗 (經牛,山羊,豚鼠,敘利亞倉鼠,馬,人,小鼠,兔,大鼠,綿羊血清吸附) |
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Donkey Anti-Goat IgG (H+L) 親和純化驢抗山羊IgG(H+L)二抗 (經雞,豚鼠,敘利亞倉鼠,馬,人,小鼠,兔,大鼠血清吸附) |
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Mouse Monoclonal Anti-Goat IgG , Light Chain Specific 單克隆小鼠抗山羊IgG,輕鏈二抗 (經馬,人,小鼠,兔,大鼠免疫球蛋白吸附) |
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Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L) 親和純化驢抗豚鼠IgG(H+L)二抗 (經牛,雞,山羊,敘利亞倉鼠,馬,人,小鼠,兔,大鼠,綿羊血清吸附) |
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Goat Anti-Armenian Hamster IgG (H+L) 親和純化山羊抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)二抗 (經牛,人,小鼠,兔,大鼠血清吸附) |
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Donkey Anti-Human IgG (H+L) 親和純化驢抗人IgG(H+L)二抗 (經牛,雞,山羊,豚鼠,敘利亞倉鼠,馬,小鼠,兔,大鼠,綿羊血清吸附) |
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Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific 親和純化山羊抗人IgG,Fcγ片段二抗 (經牛,馬,小鼠血清吸附) |
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Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific 親和純化山羊抗人IgM,與 Fc5μ片段特異性反應 (經牛血清吸附) |
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Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) 親和純化驢抗小鼠IgG(H+L)二抗 (經牛,雞,山羊,豚鼠,敘利亞倉鼠,馬,人,兔,綿羊血清吸附) |
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Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) 親和純化驢抗小鼠IgG(H+L)二抗 (經牛,雞,山羊,豚鼠,敘利亞倉鼠,馬,人,兔,大鼠,綿羊血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG (H+L) 親和純化驢抗小鼠IgG(H+L)二抗 (經人,牛,馬,兔,Sw血清吸附) |
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Antibody Description |
Alexa Fluor?680 |
Alexa Fluor?790 |
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Goat Anti-Mouse IgG (H+L) 親和純化山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗 (經大鼠,人,牛,馬,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG Fcγ fragment specific 親和純化山羊抗小鼠IgG,Fcγ片段二抗 (經人,牛,馬血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgM, μ chain specific 親和純化山羊抗小鼠IgG,與μ鏈特異性反應 (經人,牛,馬血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ subclass 1 specific 親和純化山羊抗小鼠IgG,與Fcγ亞型1特異性反應 (經人,牛,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ subclass 2a specific 親和純化山羊抗小鼠IgG, 與Fcγ亞型2a特異性反應 (經人,牛,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ subclass 2b specific 親和純化山羊抗小鼠IgG, 與Fcγ亞型2b特異性反應 (經人,牛,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ subclass 2c specific 親和純化山羊抗小鼠IgG, 與Fcγ亞型2c特異性反應 (經人,牛,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ subclass 3 specific 親和純化山羊抗小鼠IgG, 與Fcγ亞型3特異性反應 (經人,牛,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Light Chain Specific 親和純化山羊抗小鼠IgG,與輕鏈特異性反應 (經牛,山羊,馬,人,兔,大鼠,綿羊免疫球蛋白吸附) |
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Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) 親和純化驢抗兔IgG(H+L)二抗 (經牛,雞,山羊,豚鼠,敘利亞倉鼠,馬,人,小鼠,大鼠,綿羊血清吸附) |
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Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 親和純化山羊抗兔IgG(H+L)二抗 (經人,小鼠,大鼠血清吸附) |
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Mouse Monoclonal Anti-Rabbit IgG , Light Chain Specific 單克隆小鼠抗兔IgG,與輕鏈特異性反應 (經牛,山羊,ArmH小鼠,馬,人,小鼠,大鼠,綿羊免疫球蛋白吸附) |
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Antibody Description |
Alexa Fluor?680 |
Alexa Fluor?790 |
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Donkey Anti-Rat IgG (H+L) 親和純化驢抗大鼠IgG(H+L)二抗 (經牛,雞,山羊,豚鼠,敘利亞倉鼠,馬,人,兔,綿羊血清吸附) |
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Donkey Anti-Rat IgG (H+L) 親和純化驢抗大鼠IgG(H+L)二抗 (經牛,雞,山羊,豚鼠,敘利亞倉鼠,馬,人,小鼠,兔,綿羊血清吸附) |
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Goat Anti-Rat IgG (H+L) 親和純化山羊抗大鼠IgG(H+L)二抗 (經人,牛,馬,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Rat IgG, Fcγ fragment specific 純化山羊抗大鼠IgG,與Fcγ片段特異性反應 (經人,牛,馬血清吸附) |
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Goat Anti-Rat IgM, μ chain specific 純化山羊抗大鼠IgM,與μ鏈特異性反應 (經人,牛,馬血清吸附) |
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Goat Anti-Rat IgG, Light Chain Specific 親和純化山羊抗大鼠IgG,與輕鏈特異性反應 (經牛,山羊,馬,人,小鼠,兔,綿羊免疫球蛋白吸附) |
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Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) 親和純化驢抗綿羊IgG(H+L)二抗 (經雞,豚鼠,敘利亞倉鼠,馬,人,小鼠,兔,大鼠血清吸附) |
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Mouse Monoclonal Anti-Sheep IgG, Light Chain Specific 單克隆小鼠抗綿羊IgG,與輕鏈特異性反應 (經牛,馬,人,小鼠,兔,大鼠免疫球蛋白吸附) |
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Mouse Monoclonal Anti-Fluorescein 小鼠抗熒光素FITC單克隆抗體 |
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Mouse Monoclonal Anti-Digoxin 小鼠抗地高辛單克隆抗體 |
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Mouse Monoclonal Anti-Biotin 小鼠抗生物素單克隆抗體 |
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Controls |
Alexa Fluor?680 |
Alexa Fluor?790 |
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ChromPure Donkey IgG, whole molecule 色譜級驢IgG,完整分子 |
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ChromPure Goat IgG, whole molecule 色譜級山羊IgG,完整分子 |
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ChromPure Mouse IgG, whole molecule 色譜級山羊IgG,完整分子 |
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