膠質母細胞瘤（GBM）是膠質瘤中惡性程度最高的顱內腫瘤，往往呈侵襲性的生長方式，跟正常的腦組織邊界不清楚，所以手術切除非常困難，復發率非常高，往往難以治愈。通過聯合手術、聯合放療化療在內的綜合治療，臨床報道平均生存期大概僅15個月左右。因此，產生了對新療法的迫切需求。
免疫毒素療法在治療癌癥方面具有巨大潛力，最近的研究發現，D2C7免疫毒素（D2C7-IT）在GBM小鼠模型和用D2C7治療的患者顯示出有希望的結果，但其療效有限。GBM腫瘤具有難以置信的異質性，導致治療耐藥性，此外，癌癥和腫瘤相關細胞經常分泌蛋白或表達受體，抑制免疫活性，從而形成阻礙療效的免疫抑制環境。需要新的策略來克服GBM TME的挑戰。
刺激免疫活性的分子可以幫助克服癌癥細胞介導的免疫抑制。CD40是一種由不同類型細胞表達的共刺激分子，可增強T細胞活性和抗腫瘤免疫?？笴D40的激動劑抗體已被證明可激活適應性免疫和先天免疫，并可特別有效地對抗CD40高表達的癌癥類型，包括GBM。
免疫細胞的功能分析顯示了療法如何影響免疫活動，但群體分析可能會漏掉每個細胞的關鍵特征。IsoPlexis的單細胞分泌解決方案幫助研究人員分析單個細胞的功能，為免疫反應和驅動免疫活動的細胞功能提供更深入的見解。
最近杜克大學發表在Science Translational Medicine上一篇新的論文，題為“Immunotoxin-αCD40 therapy activates innate and adaptive immunity and generates a durable antitumor response in glioblastoma models”（免疫毒素-αCD40療法激活先天性和適應性免疫，并在膠質母細胞瘤模型中產生持久的抗腫瘤反應），研究人員評估了免疫毒素和抗CD40激動劑聯合治療GBM的療效。
研究思路
研究者采用遞送增強型給藥方法（convection-enhanced delivery，簡稱CED），將導管（catheter）直接插入腫瘤之中，并通過注射泵（infusion pump）給予導管正壓力，從而促進藥物分布吸收。通過CED實現生物大分子直接瘤內給藥，這些大分子往往難以通過血腦屏障，或者系統給藥時毒性太高。
他們比較了四個治療組中GBM小鼠模型的生存情況，分別為：
- Ctrl – 對照組no D2C7 or ɑCD40
- D2C7 – D2C7 單藥
- CD40 - ɑCD40 單藥
- D + C – D2C7 + ɑCD40 聯合用藥
在確定安全劑量后，研究人員表明，聯合療法能夠誘導免疫記憶，最終改善GBM模型的存活率。研究人員接下來檢查了受聯合療法影響的免疫細胞類型，發現CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）是該療法抗腫瘤作用所必需的。
文章的幾個部分利用流式細胞術和免疫組織化學對治療組腫瘤微環境中的某些免疫標記物進行表面表型和評估，發現：
- 聯合治療增加了促炎性小膠質細胞和腫瘤相關巨噬細胞的存在；
- CD8+T細胞是D+C聯合的有效性所必需的；
- D+C聯合導致CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的增加；
- 盡管這些TIL耗竭，但D+C治療組的CD8+TIL仍相當活躍；
- D+C聯合組的TIL增殖性更強，表明細胞毒性更強；
- D+C聯合的療效可以通過改變Batf3水平來調節，因為Batf3參與支持串擾和免疫群體（包括TIL）的擴增。
此外，來自腫瘤的RNA-seq顯示，D+C聯合治療的小鼠腫瘤中促炎細胞因子轉錄物的增加。
單細胞功能蛋白質組學揭示增強的CD8+功能
由于聯合療法旨在刺激免疫細胞功能，研究人員使用IsoPlexis的單細胞分泌組來表征CD8+TIL活性。在四個治療組（Ctrl、D2C7、CD40和D+C）中從GBM腫瘤中分離出CD8+TIL細胞，在37℃下用PMA/Iono刺激處理5小時，然后在小鼠單細胞適應性免疫芯片上檢測細胞因子分泌組，并通過生信分析單細胞多功能亞群（分泌2種以上因子的細胞亞群）和細胞多功能指數（PSI）。
在CT-VIII膠質瘤治療后6天，單個CD8+T細胞對不同療法的反應，與對照組相比，D2C7、αCD40和D+C處理的小鼠顯示出增強的多功能性和多功能強度指數（PSI）。雖然單藥治療增加了多功能細胞的數量，但只有聯合治療導致分泌5種或更多不同家族的細胞因子/趨化因子的高度多功能細胞亞群。
利用熱圖可視化來更好地了解治療組中分泌的細胞因子/趨化因子，評估分泌的單個細胞因子表明，免疫毒素和聯合療法都增加了分泌的細胞因子的多樣性，表明多功能細胞具有促炎表型，從蛋白組層面進一步驗證了RNA-seq的發現。D+C聯合治療的小鼠CD8+TIL細胞在各種家族中分泌10種以上的細胞因子/趨化因子，這些高度分泌的CD8+TIL僅在D+C治療組中發現。通過使用單細胞功能表型，研究人員能夠識別驅動抗腫瘤免疫反應的CD8+TIL亞群，并表明他們的聯合治療可以提高T細胞功能，這符合他們最初的假設。
用單細胞分析評價新型免疫療法
IsoPlexis的單細胞功能分析展示了新型免疫療法如何在單細胞水平上影響免疫細胞功能，揭示了驅動免疫應答的高度多功能細胞亞群。多功能性和PSI是抗腫瘤療效的有價值的生物標志物，使用單細胞功能分析來表征新的免疫療法可以確定關鍵見解，并有助于指導新療法的早期開發。
