Annexin V-mCherry細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-mCherry Apoptosis Detection Kit)是用紅色熒光蛋白mCherry標記的重組人Annexin V來檢測細胞凋亡時出現在細胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設備進行檢測。

本試劑盒檢測的是mCherry紅色熒光，mCherry熒光蛋白最大激發光波長為587nm，最大發射光波長為610nm。Annexin V-mCherry熒光蛋白的激發光譜和發射光譜參考圖1。

圖1. Annexin V-mCherry的激發和發射光光譜。

Annexin是一類廣泛分布于真核細胞細胞漿內鈣離子依賴的磷酯結合蛋白，參與細胞內的信號轉導。但僅Annexin V被報道可以調控一些PKC的活性。

Annexin V選擇性結合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細胞膜內側，即與細胞漿相鄰的一側。在細胞發生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細胞表面，即細胞膜外側。磷酯酰絲氨酸暴露到細胞表面后會促進凝血和炎癥反應。而Annexin V和外翻到細胞表面的磷酯酰絲氨酸結合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應活性。

Annexin V-mCherry相比藻紅蛋白(Phycoerythrin, 簡稱PE)標記的Annexin V，激發光譜更窄，不會像PE那樣在495nm左右產生紅色熒光，非常適合與其它綠色熒光一同檢測，在進行流式檢測時幾乎不需要進行任何補償。

正常細胞不會被Annexin V-mCherry所染色，凋亡細胞和壞死細胞都會被Annexin V-mCherry所染色。如果希望進一步區分凋亡和壞死細胞，可以使用其它細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測。使用本試劑盒檢測細胞凋亡和細胞壞死的效果參考圖2。

圖2. Annexin V-mCherry細胞凋亡檢測試劑盒檢測BGC-823 (人胃癌細胞)細胞凋亡和壞死的效果。正常狀態的BGC-823細胞在明場下的形態見圖A；正常細胞不會被Annexin V-mCherry所染色(圖C-D)。Camptothecin誘導16小時后的BGC-823細胞在明場下的形態見圖E；凋亡細胞的細胞膜呈紅色熒光(圖G-H)。實際檢測效果會因實驗條件、檢測儀器的不同而存在差異，本圖僅供參考。本試劑盒中不提供Hoechst 33342，如有需要，可向 Hoechst 33342活細胞染色液(100X)。

一個小包裝的本試劑盒C1069S共可以檢測20個樣品，中包裝的試劑盒C1069M可以檢測50個樣品，大包裝的試劑盒C1069L可以檢測100個樣品。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效。Annexin V-mCherry避光保存。

注意事項：

如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。

染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。

如果細胞收集過程中使用了胰酶，需注意設法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-mCherry，最終導致染色失敗。

熒光物質均易發生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。

需自備PBS。

本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.對于懸浮細胞：
a.在進行完細胞凋亡刺激后，1000×g (約1000-2000rpm)離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續Annexin V-mCherry的結合。
b.取5-10萬重懸的細胞，1000×g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞。
c.加入5μl Annexin V-mCherry，輕輕混勻。
d.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善標記效果。
e.隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-mCherry為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000×g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測。用于流式細胞儀檢測時，如果發現Annexin V-mCherry單獨染色時出現了過多的其它通道假陽性細胞，并且通過調整相關設置和參數也無法改善，可以用PBS將Annexin V-mCherry稀釋3-10倍后再進行檢測。
2.對于貼壁細胞：
a.把細胞培養液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液(可含有EDTA)消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
b.加入步驟2a中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1000×g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。注意：加入步驟2a中的細胞培養液一方面可以收集已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解后續加入的Annexin V-mCherry導致染色失敗。
c.取5-10萬重懸的細胞，1000×g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞。
d.加入5μl Annexin V-mCherry，輕輕混勻。
e.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善標記效果。
f.隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-mCherry為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000×g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測。用于流式細胞儀檢測時，如果發現Annexin V-mCherry單獨染色時出現了過多的其它通道假陽性細胞，并且通過調整相關設置和參數也無法改善，可以用PBS將Annexin V-mCherry稀釋3-10倍后再進行檢測。
3.對于貼壁細胞的原位熒光顯微鏡檢測：
注：本方法的優點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
a.(選做)如果條件許可，把細胞培養于24孔板、48孔板或96孔板內。在凋亡誘導結束后，用可以對多孔板進行離心的離心機1000×g離心5分鐘。
b.吸除細胞培養液，加入PBS洗滌一次。如果條件許可，在吸除PBS前1000×g離心5分鐘。
c.加入195μl Annexin V-mCherry Binding Buffer。
d.加入5μl Annexin V-mCherry，輕輕混勻。
e.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘。可以使用鋁箔進行避光。
f.隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-mCherry為紅色熒光。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測?