?ClonePix技術快速篩選和開發高表達GPCR的哺乳細胞系
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ClonePixTM 2系統提供了一種全新、快速評估哺乳細胞系GPCR靶蛋白表達水平的方法
l???????? 用哺乳表達系統快速評估GPCR靶蛋白的內源表達水平
l???????? 增加發現最優細胞反應器的可能性
l? ? ? ? ? ??減少細胞系/抗體開發的時間—避免有限稀釋法
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背景
關于細胞系的開發，從轉染細胞庫中發現和篩選高表達GPCR克隆是非常有挑戰的。ClonePix技術是已被證明的，一步法快速篩選大量異源細胞（3周10,000個克?。?。由于極其大容量的細胞庫能夠被篩選，大大增加了發現最優細胞生產器的可能性。利用白光和熒光的原位成像技術，ClonePix 2系統具有足夠的靈敏性能夠檢測細胞表面有限表達的內源性蛋白。
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材料
l?????細胞系：CHO-M1細胞系，表達內源G蛋白偶聯毒草堿1膽堿受體（ATCC,M1 WT3-CRL1985）. 親本CHO-K1細胞用作陰性對照。
l?????抗體：兔抗ChRM1-PE標記，多抗（Bioss，Cat.#ABIN668656）; 兔抗-CHRM1 多抗，無標記；（Bioss，Cat.#bs-1150R）; 山羊抗兔IgG-PE標記，多抗（Life Technologies, Cat.#P2771MP）。
l?????培養基：Ham’s F12培養基（Corning cellgro, Cat.#10-080-CV）；CloneMedia-CHO-S (Molecular Devices,Cat. #K8710); Fetal Bovine Serum (Hyclone, Cat.#SH30071.03), 1% Pen/Strep/Glutamine (Life Technologies,Cat. #10378016), 450 μg/mL Geneticin, G418 (LifeTechnologies, Cat. #10131035)。
l?????反應緩沖液：10X HBSS (Life Technologies, Cat.#14065056) 無菌水稀釋，注射用。(Irvine Scientific, Cat. #9309)，20 mM HEPES (Life Technologies, Cat. #15630080).? pH 調整到7.4。
l?????FLIPR? Calcium 6 Assay Kits (Molecular Devices, Cat.#R8190)。
l?????微孔板: 6-well non-TC treated, clear-bottom plates (Greiner Bio-One, Cat. #657185); 384-well black-wall, sterile,TC-treated, clear-bottom plates (Corning, Cat. #3072)。
l?????M1 AChR agonist: Carbamoylcholine chloride or Carbachol(Sigma, Cat. #C4382)。
儀器概述
ClonePix 2 系統
l???????? 篩選和挑取哺乳細胞克隆的自動化系統
l???????? 白光和熒光成像
l???????? 透射光支持低對比度克隆如單層貼壁細胞成像
l???????? 軟件控制5對激發/發射濾光片的切換
l???????? 用戶自定義標準進行克隆排序
l???????? 目標克隆識別和挑取到96孔目標板
l???????? 支持懸浮和貼壁細胞的多種應用
l???????? 篩選和挑取分泌抗原特異性抗體的雜交瘤細胞
l???????? 細胞系開發
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CloneSelect Imager
l???????? 無標記的白光細胞成像技術
l???????? 客觀、定量評價細胞生長
l???????? 簡單、容易使用的軟件界面
l???????? 準確獲取96孔板每個孔細胞的生長率
l???????? 支持多種應用：
l???????? 監控細胞生長
l???????? 單克隆驗證
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FLIPR Tetra 系統
l???????? 標準EMCCD熒光檢測或可選ICCD熒光和化學發光檢測
l???????? 用戶可配置96-、384-、和1536孔板
l???????? 用戶可更換的懸浮細胞選項
l???????? 獨特的，可配置激發光學拓展了熒光種類的應用
l???????? 直觀、容易使用的軟件界面
l???????? TetraCycler內置的抓板器可增加系統的通量
半固體培養基培養細胞
直接標記的方法：PE標記的CHRM1抗體隨細胞直接加到半固體培養基中。對照孔包括細胞但是沒有抗體。
雙抗體方法：直接標記的方法沒有效果的時候，用一抗和二抗測試可行性。非標記的rabbit anti-muscarinic抗體和PE標記的抗兔多克隆二抗隨細胞直接加到半固體培養基中。對照孔包含細胞但沒有抗體，連同僅僅含有二抗的對照孔。
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ClonePix2系統成像和挑取表達GPCR(M1)的細胞克隆
無論是直接標記方法還是雙抗體方法，根據ClonePix2的記錄，CHO-M1陽性細胞產生大范圍的熒光信號。圖1顯示了M1 GPCR不同程度的表達。正如預期，親本CHO-K1細胞沒有產生熒光信號。
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細胞基于形態和熒光強度被分組。挑取克隆的形態基于大小、形狀和克隆之間的鄰近度。形態學理想的克隆根據內部熒光強度排名，并設門分為四個熒光組：高、中、CHO-K1陰性和ungated（圖2）. CHO-K1陰性組被定義為背景熒光信號。所有的克隆識別對應于陰性對照孔。Ungated克隆是指低熒光信號但高于背景熒光信號的克隆。
直接標記抗體和雙抗體的方法（圖3）顯示了陽性樣品（表達M1）的熒光信號和無熒光信號的親本細胞系（圖4）。正如預期，由于一抗和二抗結合，雙抗體的方法在PE通道產生了更高的背景信號。然而ClonePix2在明場檢測細胞，然后再看細胞克隆內的熒光信號。在PE通道中識別到但在明場識別不到的物體不被當做是克隆。因此，ClonePix2系統好處是具有從背景信號中區分真實克隆的能力。
ClonePix2系統挑取的克隆CHO-M1儲存到含200μL Ham’s F12 media+10%FBS+G418的96孔Greiner板，而CHO-K1克隆儲存到同樣的微孔板但不包括G418。這些96孔板在CloneSelect Imager系統中成像確認細胞的轉移和生長（圖5）。細胞培養一周后再使用CloneSelect Imager分析確保細胞已經增殖（圖5和6）。細胞隨后轉移到384孔板，用FLIPR Tetra系統和鈣6試劑進行功能確認。
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FLIPR Tetra系統驗證ClonePix2挑取細胞的M1 GPCR表達
細胞準備
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加入鈣敏感熒光染料
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FLIPR Tetra 熒光成像讀板儀
曝光（sec）????????? 0.53
激發LED(nm)???????? 470-495
發射濾光片(nm)?????? 515-575
LED 強度(%)????????? 80%
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FLIPR 鈣6 試劑盒
FLIPR Calcium 6試劑盒驗證挑好的CHO-M1和CHO-K1細胞克隆
受配體GPCR的激活，受體構象的改變觸發胞內G蛋白的激活?；罨?/span>G蛋白具有誘導胞內的不同信使包括鈣信使的潛能。
ClonePix2系統挑取的不同組細胞用FLIPR Tetra系統來評價功能活性。在40nM的Carbachol條件下，鈣敏感熒光染料（FLIPR Calcium 6 Assays kit, Molecular Devices）用來評估胞漿中鈣離子隨著激活的G蛋白偶聯IP3敏感通路的變化而變化的可行性研究。歷史數據表明，40nM Carbachol 是 EC80的濃度。
在高熒光的CHO-M1細胞克隆中，相對背景，Carbachol產生了增加4倍的熒光讀數（圖7A）。在混合中和低熒光的CHO-M1細胞克隆中，Carbachol分別產生了4倍到2倍的熒光讀數增加（圖7B）。最后陰性對照的CHO-K1細胞，Carbachol沒有引起熒光讀數的任何變化（圖7C）。由于每組細胞，除了中和低表達熒光的混合細胞，是分別種在不同的384孔板中，在加入40nM的Carbachol之前，每孔基線熒光強度的變化都進行了背景熒光的均一化。
這些結果支持了在膜結合G蛋白偶聯毒草堿受體表達水平和功能活性之間的正相關性。缺乏熒光信號的CHO-K1細胞陰性對照進一步確認了ClonePix2系統能準確區分表面表達M1 GPCR 的細胞和表面沒有表達M1 GPCR的細胞。
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總結
ClonePix2系統能夠有效用于檢測和挑取不同GPCR表達水平的細胞克隆，因此為需要高質量GPCR蛋白的各種應用提供了唯一的資源，這些應用包括（1）使用高表達天然表位的抗原生產相應的抗體；（2）表達GPCRs困難的特殊GPCR家族的細胞功能分析。
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