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?ClonePix技術(shù)快速篩選和開(kāi)發(fā)高表達(dá)GPCR的哺乳細(xì)胞系

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ClonePix^TM 2系統(tǒng)提供了一種全新、快速評(píng)估哺乳細(xì)胞系GPCR靶蛋白表達(dá)水平的方法

l???????? 用哺乳表達(dá)系統(tǒng)快速評(píng)估GPCR靶蛋白的內(nèi)源表達(dá)水平

l???????? 增加發(fā)現(xiàn)最優(yōu)細(xì)胞反應(yīng)器的可能性

l? ? ? ? ? ??減少細(xì)胞系/抗體開(kāi)發(fā)的時(shí)間—避免有限稀釋法

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背景

哺乳細(xì)胞GPCRs的內(nèi)源表達(dá)通常是非常低的，一般不超過(guò)3,000拷貝/細(xì)胞。這些內(nèi)源表達(dá)水平足夠維護(hù)正常的受體功能，但在GPCR藥物發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用存在挑戰(zhàn)。大部分的篩選試驗(yàn)要求更高濃度的功能GPCRs呈現(xiàn)在細(xì)胞表面。例如，結(jié)構(gòu)的研究，小分子藥物設(shè)計(jì)和天然GPCR的功能抗體生產(chǎn)均需要GPCR表達(dá)水平是內(nèi)源表達(dá)水平的幾個(gè)數(shù)量級(jí)。在“低等”生物中嘗試建立表達(dá)系統(tǒng)取得的成功非常有限，由于細(xì)菌的無(wú)效折疊；酵母的低產(chǎn)和桿狀病毒不正確的翻譯后修飾。這些挑戰(zhàn)激發(fā)了藥物發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中高表達(dá)GPCR蛋白哺乳細(xì)胞系的市場(chǎng)需求。

關(guān)于細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)，從轉(zhuǎn)染細(xì)胞庫(kù)中發(fā)現(xiàn)和篩選高表達(dá)GPCR克隆是非常有挑戰(zhàn)的。ClonePix技術(shù)是已被證明的，一步法快速篩選大量異源細(xì)胞（3周10,000個(gè)克隆）。由于極其大容量的細(xì)胞庫(kù)能夠被篩選，大大增加了發(fā)現(xiàn)最優(yōu)細(xì)胞生產(chǎn)器的可能性。利用白光和熒光的原位成像技術(shù)，ClonePix 2系統(tǒng)具有足夠的靈敏性能夠檢測(cè)細(xì)胞表面有限表達(dá)的內(nèi)源性蛋白。

?方法

表達(dá)內(nèi)源G蛋白偶聯(lián)毒草堿1膽堿受體（GPCR-M1）的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系CHO-M1被選擇來(lái)演示ClonePix2系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)蛋白的可行性。CHO-M1表達(dá)克隆用PE標(biāo)記的抗-M1的抗體來(lái)篩選，ClonePix2基于熒光強(qiáng)度選擇和挑選細(xì)胞。野生型的CHO-K1細(xì)胞系作為陰性對(duì)照。客觀評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)及無(wú)標(biāo)記技術(shù)的CloneSelect Imager系統(tǒng)，用來(lái)監(jiān)控ClonePix2系統(tǒng)挑選細(xì)胞的增殖。FLIPR Tetra高通量細(xì)胞篩選系統(tǒng)和FLIPR Calcium 6試劑盒用來(lái)驗(yàn)證ClonePix2系統(tǒng)分離細(xì)胞克隆的功能。 FLIPR Tetra系統(tǒng)使用鈣敏感熒光報(bào)告染料進(jìn)行高通量功能細(xì)胞測(cè)定，是藥物發(fā)現(xiàn)研究中評(píng)估GPCR激活引起的胞內(nèi)鈣反應(yīng)的首選工具。

材料

l?????細(xì)胞系：CHO-M1細(xì)胞系，表達(dá)內(nèi)源G蛋白偶聯(lián)毒草堿1膽堿受體（ATCC,M1 WT3-CRL1985）. 親本CHO-K1細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

l?????抗體：兔抗ChRM1-PE標(biāo)記，多抗（Bioss，Cat.#ABIN668656）; 兔抗-CHRM1 多抗，無(wú)標(biāo)記；（Bioss，Cat.#bs-1150R）; 山羊抗兔IgG-PE標(biāo)記，多抗（Life Technologies, Cat.#P2771MP）。

l?????培養(yǎng)基：Ham’s F12培養(yǎng)基（Corning cellgro, Cat.#10-080-CV）；CloneMedia-CHO-S (Molecular Devices,Cat. #K8710); Fetal Bovine Serum (Hyclone, Cat.#SH30071.03), 1% Pen/Strep/Glutamine (Life Technologies,Cat. #10378016), 450 μg/mL Geneticin, G418 (LifeTechnologies, Cat. #10131035)。

l?????反應(yīng)緩沖液：10X HBSS (Life Technologies, Cat.#14065056) 無(wú)菌水稀釋?zhuān)⑸溆谩?/span>(Irvine Scientific, Cat. #9309)，20 mM HEPES (Life Technologies, Cat. #15630080).? pH 調(diào)整到7.4。

l?????FLIPR? Calcium 6 Assay Kits (Molecular Devices, Cat.#R8190)。

l?????微孔板: 6-well non-TC treated, clear-bottom plates (Greiner Bio-One, Cat. #657185); 384-well black-wall, sterile,TC-treated, clear-bottom plates (Corning, Cat. #3072)。

l?????M1 AChR agonist: Carbamoylcholine chloride or Carbachol(Sigma, Cat. #C4382)。

儀器概述

ClonePix 2 系統(tǒng)

l???????? 篩選和挑取哺乳細(xì)胞克隆的自動(dòng)化系統(tǒng)

l???????? 白光和熒光成像

l???????? 透射光支持低對(duì)比度克隆如單層貼壁細(xì)胞成像

l???????? 軟件控制5對(duì)激發(fā)/發(fā)射濾光片的切換

l???????? 用戶(hù)自定義標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行克隆排序

l???????? 目標(biāo)克隆識(shí)別和挑取到96孔目標(biāo)板

l???????? 支持懸浮和貼壁細(xì)胞的多種應(yīng)用

l???????? 篩選和挑取分泌抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞

l???????? 細(xì)胞系開(kāi)發(fā)

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CloneSelect Imager

l???????? 無(wú)標(biāo)記的白光細(xì)胞成像技術(shù)

l???????? 客觀、定量評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)

l???????? 簡(jiǎn)單、容易使用的軟件界面

l???????? 準(zhǔn)確獲取96孔板每個(gè)孔細(xì)胞的生長(zhǎng)率

l???????? 支持多種應(yīng)用：

l???????? 監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)

l???????? 單克隆驗(yàn)證

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FLIPR Tetra 系統(tǒng)

l???????? 標(biāo)準(zhǔn)EMCCD熒光檢測(cè)或可選ICCD熒光和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

l???????? 用戶(hù)可配置96-、384-、和1536孔板

l???????? 用戶(hù)可更換的懸浮細(xì)胞選項(xiàng)

l???????? 獨(dú)特的，可配置激發(fā)光學(xué)拓展了熒光種類(lèi)的應(yīng)用

l???????? 直觀、容易使用的軟件界面

l???????? TetraCycler內(nèi)置的抓板器可增加系統(tǒng)的通量

半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞

CHO-M1和CHO-K1細(xì)胞系：CHO-M1和親本CHO-K1細(xì)胞種在CloneMedia CHO（K8710）培養(yǎng)基中，每孔1000個(gè)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)8-10天直到離散克隆形成。新傳代的細(xì)胞和前幾代的細(xì)胞分別種在培養(yǎng)基中，觀察M1 GPCR的不同表達(dá)水平。

直接標(biāo)記的方法：PE標(biāo)記的CHRM1抗體隨細(xì)胞直接加到半固體培養(yǎng)基中。對(duì)照孔包括細(xì)胞但是沒(méi)有抗體。

雙抗體方法：直接標(biāo)記的方法沒(méi)有效果的時(shí)候，用一抗和二抗測(cè)試可行性。非標(biāo)記的rabbit anti-muscarinic抗體和PE標(biāo)記的抗兔多克隆二抗隨細(xì)胞直接加到半固體培養(yǎng)基中。對(duì)照孔包含細(xì)胞但沒(méi)有抗體，連同僅僅含有二抗的對(duì)照孔。

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ClonePix2系統(tǒng)成像和挑取表達(dá)GPCR(M1)的細(xì)胞克隆

ClonePix2 成像和挑取陽(yáng)性（CHO-M1）和陰性（CHO-K1）細(xì)胞。明場(chǎng)成像識(shí)別每個(gè)克隆的位置和形態(tài)，熒光成像識(shí)別高表達(dá)的M1。對(duì)PE標(biāo)記的抗體，使用Cy5通道曝光6,000ms。

無(wú)論是直接標(biāo)記方法還是雙抗體方法，根據(jù)ClonePix2的記錄，CHO-M1陽(yáng)性細(xì)胞產(chǎn)生大范圍的熒光信號(hào)。圖1顯示了M1 GPCR不同程度的表達(dá)。正如預(yù)期，親本CHO-K1細(xì)胞沒(méi)有產(chǎn)生熒光信號(hào)。

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細(xì)胞基于形態(tài)和熒光強(qiáng)度被分組。挑取克隆的形態(tài)基于大小、形狀和克隆之間的鄰近度。形態(tài)學(xué)理想的克隆根據(jù)內(nèi)部熒光強(qiáng)度排名，并設(shè)門(mén)分為四個(gè)熒光組：高、中、CHO-K1陰性和ungated（圖2）. CHO-K1陰性組被定義為背景熒光信號(hào)。所有的克隆識(shí)別對(duì)應(yīng)于陰性對(duì)照孔。Ungated克隆是指低熒光信號(hào)但高于背景熒光信號(hào)的克隆。

直接標(biāo)記抗體和雙抗體的方法（圖3）顯示了陽(yáng)性樣品（表達(dá)M1）的熒光信號(hào)和無(wú)熒光信號(hào)的親本細(xì)胞系（圖4）。正如預(yù)期，由于一抗和二抗結(jié)合，雙抗體的方法在PE通道產(chǎn)生了更高的背景信號(hào)。然而ClonePix2在明場(chǎng)檢測(cè)細(xì)胞，然后再看細(xì)胞克隆內(nèi)的熒光信號(hào)。在PE通道中識(shí)別到但在明場(chǎng)識(shí)別不到的物體不被當(dāng)做是克隆。因此，ClonePix2系統(tǒng)好處是具有從背景信號(hào)中區(qū)分真實(shí)克隆的能力。

ClonePix2系統(tǒng)挑取的克隆CHO-M1儲(chǔ)存到含200μL Ham’s F12 media+10%FBS+G418的96孔Greiner板，而CHO-K1克隆儲(chǔ)存到同樣的微孔板但不包括G418。這些96孔板在CloneSelect Imager系統(tǒng)中成像確認(rèn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)（圖5）。細(xì)胞培養(yǎng)一周后再使用CloneSelect Imager分析確保細(xì)胞已經(jīng)增殖（圖5和6）。細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)移到384孔板，用FLIPR Tetra系統(tǒng)和鈣6試劑進(jìn)行功能確認(rèn)。

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FLIPR Tetra系統(tǒng)驗(yàn)證ClonePix2挑取細(xì)胞的M1 GPCR表達(dá)

細(xì)胞準(zhǔn)備

ClonePix2系統(tǒng)挑取的細(xì)胞種到384孔，每孔25μL培養(yǎng)基，5,000個(gè)細(xì)胞，37℃,95%濕度和5%CO₂過(guò)夜培養(yǎng)。這些細(xì)胞分選為四個(gè)組：高、中、低和no M1表達(dá)。

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加入鈣敏感熒光染料

從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫平衡。25μL的FLIPR Calcium 6 染料直接加入含培養(yǎng)基的細(xì)胞板。這些板孔中加入2.5Mm的丙磺舒阻止有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)，37℃孵育2小時(shí)。室溫保持直到熒光讀數(shù)。

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FLIPR Tetra 熒光成像讀板儀

孵育和室溫平衡后，放一塊板到FLIPR系統(tǒng)中，FLIPR系統(tǒng)ICCD相機(jī)捕獲熒光鈣信號(hào)，成像參數(shù)如下：

曝光（sec）????????? 0.53

激發(fā)LED(nm)???????? 470-495

發(fā)射濾光片(nm)?????? 515-575

LED 強(qiáng)度(%)????????? 80%

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FLIPR 鈣6 試劑盒

每秒熒光讀數(shù)，分別在加Carbachol之前讀10個(gè)點(diǎn)，加40nm的Carbachol之后讀60點(diǎn)。Carbachol的起始濃度是終濃度的5倍。Carbachol的加入體積是12.5μL ，分液速度是20μL/sec.

FLIPR Calcium 6試劑盒驗(yàn)證挑好的CHO-M1和CHO-K1細(xì)胞克隆

膜結(jié)合G蛋白偶聯(lián)毒草堿受體表達(dá)水平用標(biāo)記PE的抗M1最新傳代細(xì)胞和初始的CHO-M1細(xì)胞，預(yù)期的結(jié)果是初始的CHO-M1細(xì)胞M1 GPCR的表達(dá)水平將大大低于最新傳代的細(xì)胞。親本的CHO-K1細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

受配體GPCR的激活，受體構(gòu)象的改變觸發(fā)胞內(nèi)G蛋白的激活。活化的G蛋白具有誘導(dǎo)胞內(nèi)的不同信使包括鈣信使的潛能。

ClonePix2系統(tǒng)挑取的不同組細(xì)胞用FLIPR Tetra系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)功能活性。在40nM的Carbachol條件下，鈣敏感熒光染料（FLIPR Calcium 6 Assays kit, Molecular Devices）用來(lái)評(píng)估胞漿中鈣離子隨著激活的G蛋白偶聯(lián)IP3敏感通路的變化而變化的可行性研究。歷史數(shù)據(jù)表明，40nM Carbachol 是 EC80的濃度。

在高熒光的CHO-M1細(xì)胞克隆中，相對(duì)背景，Carbachol產(chǎn)生了增加4倍的熒光讀數(shù)（圖7A）。在混合中和低熒光的CHO-M1細(xì)胞克隆中，Carbachol分別產(chǎn)生了4倍到2倍的熒光讀數(shù)增加（圖7B）。最后陰性對(duì)照的CHO-K1細(xì)胞，Carbachol沒(méi)有引起熒光讀數(shù)的任何變化（圖7C）。由于每組細(xì)胞，除了中和低表達(dá)熒光的混合細(xì)胞，是分別種在不同的384孔板中，在加入40nM的Carbachol之前，每孔基線(xiàn)熒光強(qiáng)度的變化都進(jìn)行了背景熒光的均一化。

這些結(jié)果支持了在膜結(jié)合G蛋白偶聯(lián)毒草堿受體表達(dá)水平和功能活性之間的正相關(guān)性。缺乏熒光信號(hào)的CHO-K1細(xì)胞陰性對(duì)照進(jìn)一步確認(rèn)了ClonePix2系統(tǒng)能準(zhǔn)確區(qū)分表面表達(dá)M1 GPCR 的細(xì)胞和表面沒(méi)有表達(dá)M1 GPCR的細(xì)胞。

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總結(jié)

為了滿(mǎn)足高通量篩選和選擇性需求分析，GPCR轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是細(xì)胞功能試驗(yàn)強(qiáng)有力、獨(dú)特和規(guī)范的研究平臺(tái)。本文的結(jié)論是初步的研究揭示了ClonePix2系統(tǒng)能可靠地檢測(cè)GPCR不同表達(dá)水平的細(xì)胞克隆。而且，熒光強(qiáng)度和FLIPR Tetra系統(tǒng)測(cè)定的GPCR介導(dǎo)的胞漿內(nèi)鈣離子水平的變化呈現(xiàn)正關(guān)聯(lián)，這些鈣離子的變化恰恰膜結(jié)合G蛋白偶聯(lián)毒草堿受體M1表達(dá)差異導(dǎo)致的。

ClonePix2系統(tǒng)能夠有效用于檢測(cè)和挑取不同GPCR表達(dá)水平的細(xì)胞克隆，因此為需要高質(zhì)量GPCR蛋白的各種應(yīng)用提供了唯一的資源，這些應(yīng)用包括（1）使用高表達(dá)天然表位的抗原生產(chǎn)相應(yīng)的抗體；（2）表達(dá)GPCRs困難的特殊GPCR家族的細(xì)胞功能分析。

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