本文主要解析了穩定細胞系構建的原理和穩定細胞系建立的流程，及瞬時轉染和穩定細胞系構建的區別與聯系。幫助我們選擇合適的細胞轉染的方法，瞬時轉染或穩定轉染細胞
真核蛋白表達的方式有兩種：瞬時轉染和穩定轉染（穩定細胞系構建）。根據自身真核蛋白表達的目的選擇合適的轉染方法非常重要。瞬時轉染持續時間較短，質粒轉染進入細胞，3-4天就會丟失。因此可以得到少量的蛋白。相對于此，穩定抵不住篩選是一個長期的過程，需要足夠的耐心和細心。
穩定細胞系構建原理
真核蛋白表達穩定細胞系建立的原理是，將我們所要的目的基因真核到宿主細胞上，隨著細胞的生長繁殖，目的基因可以穩定的表達，在通過抗生素的不斷加壓篩選，最終得到構建穩定細胞系的過程。相對于瞬時轉染，穩定轉染技術持續周期長，細胞整合穩定，能夠滿足后期對蛋白的大量需求。
穩定細胞系構建 ?實驗流程
1.細胞培養
細胞培養是真核蛋白蛋白實驗中的第一步，原核利用大腸桿菌，真核蛋白表達是培養哺乳動物細胞，常用的真核蛋白表達細胞有CHO,HEK293細胞，穩定細胞系建立選擇CHO細胞。
細胞復蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細胞株解凍并重新培養的過程。細胞復蘇的關鍵是快復，防止在解凍過程中，產生的水珠形成冰晶損傷細胞。細胞復蘇一般步驟如下：
1）預先加熱水浴鍋，溫度至37-40℃，并在離心管中準備好10ml培養基
2）從液氮罐或冰箱中取出細胞，迅速放進預熱的水浴鍋中，鑷子夾住凍存管晃動，使其受熱均勻
3）當凍存管內完全融化時，注意用酒精擦拭凍存管消毒，將液體倒入含有10ml培養基的離心管中
4）離心5min，去除上清，得到沉淀
5）用培養基懸浮沉淀，并接種到培養瓶常規培養
細胞復蘇后，生長一段時間，95%的細胞貼壁生長，細胞狀態良好，說明細胞復蘇成功。
2.穩定細胞系構建（一）
以Lipofectamine轉染試劑為例進行先瞬時轉染，不同轉染試劑參考說明書
1）將復蘇后常規培養的細胞按照1-3x10^5接種到6孔板中，加入2-4ml的完全培養基，混勻放置在二氧化碳培養箱中37℃過夜
2）無菌狀態下配置如下溶液：a?用100ul的無血清培養基稀釋2ug的待轉染的質粒
b?用100ul的無血清培養基稀釋25ul的Lipofectamine轉染試劑（血清的存在會影響轉染效率，因此要使用無血清培養基轉染）
3）將ab溶液混合并搖勻，室溫下放置30min左右
4）細胞培養至80%單層左右，用無血清培養基洗滌細胞2次，每孔加入1ml的無血清培養基，并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養箱中37℃培養24小時
5）將轉染液倒出，換為完全培養基繼續培養
3.穩定細胞系建立
24-72h加入選擇性抗生素進行穩定細胞株篩選，預實驗確定抗生素的最佳濃度，確定抗生素對所選細胞的最低作用濃度。
5）Western?blot或ELISA檢測蛋白的表達情況，挑取多個單克隆進行表達檢測，篩選出表達量最高的克隆傳代保存。
最終篩選出穩定高表達目的基因的細胞株，相對于瞬時轉染穩定細胞系構建在后續可以節約大量的時間和成本，是滿足活性蛋白大量制備的最好方法。
真核系統蛋白表達的操作較為繁瑣，困難，有一定的操作難點，相對原核表達得到的蛋白更具天然活性，同酵母表達相似，可以實現蛋白的各種修飾，只是真核蛋白表達可以實現蛋白的復雜、高級修飾。在制藥，活性因子生產方面有很大應用。
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