*文章轉載自求實藥社

ING 2021 第四屆免疫及基因治療論壇組委會有幸邀請到IsoPlexis亞太區應用經理 李倩博士基于IsoPlxis分析平臺的優勢，以采訪形式分享了對單細胞蛋白質組學未來的發展前景與應用前景的看法、IsoPlexis對單細胞蛋白質學技術研發難點的見解、單細胞多組學分析技術對腫瘤免疫治療提供的幾點新思路和解決方案等內容。

李倩博士

IsoPlexis

亞太區應用經理

李倩博士畢業于北京大學醫學部免疫學專業，研究方向主要為抑癌基因對T細胞和B細胞發育及免疫功能的影響。目前擔任IsoPlexis公司亞太區應用經理，支持單細胞功能蛋白質組學分析平臺的轉化應用，她擁有豐富的免疫學、腫瘤學、細胞生物學等領域的應用經驗，為許多科研及工業用戶提供應用支持和整體解決方案，包括細胞治療、生物制藥、腫瘤免疫研究等領域。在加入IsoPlexis前，她曾供職于德國美天旎和賽多利斯公司，擁有多年從業經驗，負責多種高通量細胞分析、細胞分選和原代樣本處理等細胞相關產品的技術支持工作。

Q：據統計，過去10年間，對于單細胞蛋白質組學的熱議一直不斷，大家對于單細胞蛋白質組學的熱情也只增不減，您是如何看待單細胞蛋白質組學未來的發展前景與應用前景？

目前單細胞蛋白質組學技術主要應用于腫瘤免疫、細胞治療、炎癥、自身免疫性疾病、干細胞、神經系統疾病等領域，隨著檢測蛋白指標種類的完善和數量的增加，未來將可能應用到越來越廣闊的研究領域。

實際上，與流式細胞技術和單細胞測序相比，單細胞蛋白質組學技術目前仍處于起步階段，作為單細胞多組學技術的一個重要補充，相信未來將會更多地與其他單細胞技術進行聯合應用，以獲得更豐富和深入的多組學信息，如探討轉錄組水平和蛋白水平之間的調控機制，幫助探討生物發育和疾病發生機制，為藥物開發提供更多依據。

單細胞功能蛋白組學提供單細胞功能表型信息

隨著微流控、光學檢測、生物物理和電子工程等其他技術的創新，我們有理由相信單細胞蛋白質組學檢測技術將有更多的突破，如實現更高的通量、更高的單細胞捕獲效率、更高的靈敏度以及更豐富的檢測指標和組合，隨著這些方面的改進及應用普及，檢測成本也將大大降低，讓更多的實驗室可以無負擔的使用該技術進一步推動研究進展。

Q：請您簡單介紹一下IsoPlxis的單細胞功能蛋白質組學分析平臺，與其他分析平臺相比，IsoPlxis的分析平臺有何優勢？

Isoplexis單細胞功能蛋白質組分析平臺采用微流控技術，通過IsoCode芯片上的12,000個獨立的亞納升級別的微室同時捕獲上千個單細胞，搭配IsoCode芯片抗體條形碼技術，可以捕獲每個小室中單個活細胞分泌的多重蛋白質，或者對單細胞裂解后釋放出的多重磷酸化蛋白進行捕獲，然后通過基于熒光ELISA原理的全自動化蛋白檢測技術，捕獲多重蛋白的熒光信號，一次可檢測多達30種以上的蛋白質。在檢測中從每個單細胞獲得的蛋白質組信號將無縫傳輸到IsoSpeak生信分析軟件，進行全自動分析和可視化數據呈現，得到的圖表可直接用于文章發表。

單細胞功能蛋白組檢測原理示意圖

與其他分析平臺相比，IsoPlexis的單細胞功能蛋白質組學分析平臺聚焦在細胞功能的分析上，且可以提供傳統分析方法無法實現的單細胞分辨率。它以獨有的單細胞分泌蛋白組分析群體細胞中真正發揮關鍵作用的多功能細胞亞群，如在疾病中發揮重要保護作用的超級細胞亞群以及損傷機體的不良細胞亞群，從而展示出新的生物學新價值，即與臨床治療結局建立相關性。我們目前已經創建了50 多個數據集，可以在臨床前期從預測的角度揭示具有更持久療效的最佳免疫聯合療法、細胞治療或疫苗候選物。在臨床階段，我們展示了PSI作為一種新型生物標志物用于預測患者臨床緩解，以實現更好的精準治療。

此外，IsoPlexis單細胞磷酸化蛋白質組學可以對細胞內信號通路相關的多重磷酸化蛋白進行檢測，并在當天獲得結果。在傳統方法中，磷酸化蛋白被用于鑒定單個蛋白質的功能，而沒有關于它們如何協同作用的見解。IsoPlexis單細胞磷酸化蛋白質組能夠提供整個蛋白質信號傳導通路的背景信息，從而揭示整體信號網絡如何運作，讓研究人員可以更好地了解異常細胞的下游效應，更好地評估癌癥靶向治療療效，將免疫治療和靶向治療推進到一個更加精確和個性化的階段。

目前我們提供IsoLight、IsoSpark和IsoSpark Duo三款型號的設備，實現不同檢測通量的需要。同時，我們已經在北京、上海、深圳設立合作實驗室，提供對外實驗測試服務，讓感興趣的研究人員可以先行體驗單細胞蛋白質組技術

Q：單細胞蛋白質學技術在研發過程中，存在哪些技術難點亟待解決？IsoPlexis作為一家單細胞多重功能蛋白質檢測解決方案的供應商，對這些技術難點有何獨特見解？

首先，我們來解析下單細胞功能蛋白質組學技術。主要可以從兩個層面來看，一個是單細胞層面，由于細胞群體樣本具有很大異質性，比如腫瘤細胞、免疫細胞、干細胞等，即使是表型完全一致的細胞亞群在功能層面上細胞之間也存在較多差異。傳統的檢測方法只能檢測相關樣品中分泌到溶液中的各類蛋白的平均濃度，這是諸多細胞和組織的共同分泌的結果，只能得到被平均化的結果，往往與后期實驗結果、篩選目標細胞類群、分析免疫治療產品效能和預測患者治療效果等方面的相關性較差，極大地限制了相關研究和應用轉化。

表型相似的細胞可能功能差異

第二個是蛋白質層面，目前的單細胞技術包括細胞表型分析，如流式細胞分析技術，基因組層面的單細胞分析，如單細胞基因組、轉錄組、表觀遺傳組等，也是近幾年非常受到關注的技術。而單細胞蛋白組層面的分析技術可以從功能層面對現有的單細胞技術進行補充，從而與體內生理學及臨床應用建立相關性，這方面的技術目前還是比較稀少的。

這個技術的難度在于如何在單細胞的層面實現多重功能蛋白質的檢測，單細胞蛋白檢測勢必要求比較高的靈敏度，而同時檢測多種蛋白則對所使用的捕獲抗體和檢測抗體提出了更高的要求，以避免產生相互信號干擾?，F如今的蛋白檢測方法要么在通量上尋求突破，要么在檢測靈敏度上追求極限，很難做到二者的兼顧。

另外，如何選擇檢測蛋白的種類以反映細胞的真實功能也是需要考量的因素，包括細胞在外界刺激下分泌的蛋白及胞內信號通路激活涉及的磷酸化蛋白等。參與生物反應和行為的蛋白種類多達數百種，如何從中選出有代表性的蛋白指標，盡量降低檢測成本，同時能綜合反應細胞對外界不同刺激條件或藥物處理后的反應，需要大量的前期數據積累和反復驗證。

最后，基于單細胞蛋白質組學獲得的大量生物學信息，如何將它轉化為可指導下一步決策的定量指標，獲得有意義的數據也是非常重要的。在當今的大數據時代，獲得海量數據不再困難，而要從大數據中搜索出有效信息，則是目前面臨的一個新挑戰。

Q：IsoPlexis單細胞蛋白組技術使用了一種綜合的評價標尺——細胞多功能指數(PSI)，對細胞的功能進行表征。請您再詳細介紹一下PSI在CART細胞治療中是如何應用的?

在CAR-T細胞治療中，IsoPlexis單細胞蛋白組學分析有著非常廣泛的應用。它通過對CAR-T細胞在抗腫瘤應答過程中分泌的多種細胞因子進行單細胞維度的分析，從而鑒定出在整個CAR-T細胞群體中真正發揮強大作用的其中一部分CAR-T細胞亞群，亦即可分泌兩種或以上細胞因子的細胞，我們稱之為多功能細胞，這部分細胞可能只占整個細胞群體的20%，甚至更少，而多項研究證實，這群細胞的存在與CAR-T細胞治療病人的療效有著顯著相關性。衡量這群多功能細胞效應的指標我們叫做“細胞多功能指數（polyfunctional strength index, PSI）”。

因此，IsoPlexis單細胞功能蛋白組學分析平臺通過評估免疫細胞應答情況，可用于細胞治療產品回輸病人前的質量評估和療效預測，在研發中可用于鑒定具有更高功效和更低免疫毒性的細胞治療產品，從而助力細胞治療產品的開發，實現更好的精準醫療。

早在2018年，Kite Pharma就在《Blood》上發表了CD19 CAR-T產品治療非霍奇金淋巴瘤的一期臨床試驗數據，其中采用單細胞蛋白質組學技術檢測到CAR-T細胞產品回輸前的PSI與治療后癌癥患者的客觀緩解呈統計學顯著相關性。研究人員同時也使用了流式細胞分析技術和ELISA檢測CAR-T產品的細胞表型和細胞因子分泌情況，但只有單細胞蛋白質組學分析能在這項血液瘤臨床試驗中區分出該細胞治療產品的有效者和無效者。

在2021年7月最新發表在《Nature Medicine》上的一篇關于雙特異性CD19/CD22 CAR-T細胞治療復發和難治性B細胞腫瘤的一期臨床試驗中也用到單細胞蛋白質組學技術比較雙特異性CAR-T細胞在不同靶抗原刺激產生的T細胞應答強弱，以及與單特異性CAR-T細胞相比的效力，以此去探討腫瘤抗原逃逸引起的疾病進展/復發的作用機制。這篇文章顯示CD19抗原丟失是導致CD19 CAR-T細胞耐藥的主要原因，突出了跨靶點設計具有同等效力的多特異性CAR-T細胞的挑戰，并確定細胞因子的產生可作為CAR - T細胞效力的一個重要質量指標。

除了CAR-T細胞治療，在其他類型的細胞治療中，如TCR-T、TIL、CAR-NK等細胞治療，IsoPlexis單細胞蛋白組學技術也有越來越多的應用，敬請大家繼續關注。

Q：由于單細胞蛋白組學研究的發展，促進了科研人員對于單細胞轉錄組學與單細胞蛋白組學聯合分析等單細胞多組學助力免疫治療的研究工作，單細胞多組學分析技術會對腫瘤免疫治療提供哪些新思路和解決方案？

單細胞多組學包括細胞層面、基因層面和蛋白層面的單細胞分析，每個維度提供的信息可互相補充，幫助進一步加深對免疫作用機理的探索，推進抗腫瘤研究及治療開發。目前在免疫治療領域，已有多項研究及臨床試驗數據證實，單細胞蛋白質組學技術可用于免疫相關治療的體外療效評估，以及預測病人的臨床結局，包括基于PD-1抗體的聯合免疫療法、雙特異性抗體、細胞治療（CAR-T）、腫瘤疫苗開發等。

比如在2021年7月，來自德克薩斯大學安德森癌癥中心的Adi Diab博士課題組，在《Journal of Clinical Oncology》期刊上發表了題為“Bempegaldesleukin Plus Nivolumab in First-Line Metastatic Melanoma”的文章。作者在利用單細胞蛋白質組學技術對患者治療前后外周血中T細胞和NK細胞的單細胞多功能強度指數（PSI）進行了分析，發現CD8+細胞的PSI增加與患者客觀緩解改善呈正相關，通過這一生物標志物可以讓研究人員比以前的傳統技術更早地評估患者對納武單抗/BEMPEG聯合治療的反應。此外，在為期3年的隨訪中，治療前后CD8+ PSD（PSI差異）高的患者表現出更高的客觀緩解率，或治療結果改善，這突出了PSI作為一種與患者緩解呈正相關的預測性生物標志物的潛力。