實驗室的垃圾分類

Western blot? ??IHC

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? ? ? ? ? 眾所周知，Western blot(WB)和免疫組化(IHC)都屬于免疫學常用的實驗技術。WB是通過SDS-PAGE分離蛋白質樣品，然后轉移到固相載體上，利用抗原與抗體特異性結合的原理進行樣品檢測，可用于定性和半定量。而IHC是融合了免疫學原理（抗原抗體特異性結合）和組織學技術（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，對組織（細胞）內抗原進行定位、定性及通過Image J進行定量的研究(主要是定位)。與WB相比，IHC實驗步驟復雜，涉及的試劑和物品種類繁多，所以IHC的垃圾分類更要認真對待。那么，IHC實驗中的垃圾到底有哪些？又該如何分類呢？索萊寶從IHC的實驗步驟開始和大家逐一敘述。

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IHC(石蠟切片)都有哪些步驟

一、?石蠟組織切片制作

1. 固定：使組織樣本盡量保持其離體前狀態，多采用4%多聚甲醛固定液。

2. 脫水：水和透明劑不能互溶，只有脫去水分后，才能讓透明劑進入。使用梯度乙醇進行脫水。75%、85%、95%、100%、100%乙醇，每步1h-2h左右。

3. 透明：乙醇不能與石蠟相溶，還需用能與乙醇和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內的乙醇。二甲苯是常用的透明劑，可以很好地與石蠟互溶。將組織依次放入二甲苯與無水乙醇的等體積混合液、純二甲苯和純二甲苯中進行透明。

4. 浸蠟與包埋：用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用，便于在切片機上夾持切片。用于包埋石蠟的熔點在50~60℃之間。

5. 切片：將包埋組織的蠟塊固定在切片機上，切片厚度一般為4~8μM。

6. 貼片：把切片放入50℃水中，攤平后用多聚賴氨酸處理過的載玻片撈起，室溫晾干。

二、?脫蠟復水

1. 干燥后的切片需脫蠟及復水才能在水溶性染液中進行染色。如果不經過復水，直接進入染色劑中，材料將會嚴重變形，甚至難以染色。

2. 先烤片，將切片放于60℃烘箱中烘烤。

3. 二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10~15min。

4. 放入100%、100%、95%、85%、75%等梯度乙醇溶液中各3min。

5. 放入蒸餾水洗兩次×5min。PBS（或PBST）洗三次×3 min。

三、?抗原修復

1. 甲醛的固定使細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽。在染色前需進行抗原修復或暴露。

2. 將切片浸入0.01M檸檬酸鹽緩沖液中，再放入微波爐中加熱10 min，之后冷卻切片?；蛘撸肊DTA-胰蛋白酶消化液37℃消化10 min。

3. PBS（或PBST）洗三次×3 min。用吸水紙將切片組織周圍擦干。

四、?滅活內源性過氧化氫酶

1. 去除組織中的內源性酶催化底物，避免染色的非特異性。

2. 用免疫組化筆圈出樣品，滴加3%過氧化氫溶液孵育10min。

3. PBS（或PBST）洗三次×3 min。

五、?封閉

1. 為減少背景產生的非特異性染色，使用非免疫動物血清進行封閉。

2. 滴加動物血清封閉液，室溫封閉30min。

3. 甩去多余液體，用吸水紙將切片組織周圍擦干。

六、?抗體結合

1. 滴加一抗，4℃孵育過夜。

2. PBS（或PBST）洗三次×3 min。

3. 滴加辣根酶標記的二抗，37℃孵育30min。

4. PBS（或PBST）洗三次×3 min。

七、?底物顯色

DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度，然后PBS或自來水沖洗1min。

八、?復染

1. 襯托出組織細胞的形態結構，更好地對目標蛋白進行定位。

2. 蘇木素復染1-3min。

3. PBS或自來水沖洗1min。

九、?分化

1%的鹽酸酒精分化2～3秒，PBS或自來水沖洗兩次×5min。

十、?脫水和透明

1. 75%，85%，95%，100%，100%的乙醇浸泡各2min。

2. 二甲苯浸泡兩次×2min。

十一、?封片

用蓋玻片和中性樹膠進行封片。之后鏡檢。

IHC(冰凍切片)實驗怎么做

一、冰凍

將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內（直徑約2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內，當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存備用，或置入恒冷箱切片機冰凍切片。

注意：針對儲存在-80℃溫度下的組織，切片前，從冷凍柜中取出組織樣品，在-20℃的溫度下均衡約15分鐘。這樣可以防止切片在封閉時破裂。

二、切片

用OCT包埋劑浸沒組織。將組織切成厚度在6-8μm之間的切片，置于多聚賴氨酸粘附的載玻片上。固定前，將切片放置在工作臺上風干幾分鐘（這樣可以增加切片的粘附作用）。

三、固定

選擇適宜的固定劑，可采用丙酮固定，-20℃下冷凍10分鐘，風干。

之后，同上面實驗步驟：滅活內源性過氧化氫酶→封閉→抗體結合→底物顯色→復染→分化→脫水透明→封片→鏡檢。

IHC實驗垃圾怎么分類

備注：根據情況可進行相應的消毒滅菌后，再裝入對應顏色的垃圾袋中，交給有資質的公司，統一回收，進行無害化處理。

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