實時熒光QPCR科普問答
天呈醫流整理發布
&?? ?問：什么是QPCR？
答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統，簡稱QPCR。
&?? ?問：QPCR、DNA檢測、PCR之間的關系？
答：聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction簡稱PCR）原理憑借敏感、特異、快速的特點榮獲93年諾貝爾化學獎。因其在病原體檢測方面的獨特優勢，因而發達國家在相關方法和儀器方面的研發非常快，成為分子生物學診斷的主流，至今仍處于學術和應用前沿：
第一代產品：
基因擴增熱循環儀（DNA Thermal Cycler）+電泳儀+紫外分析儀+定性試劑，構成PCR定性檢測。
第二代產品：
基因擴增熱循環儀+熒光儀+終點定量試劑，構成PCR-DNA終點法定量檢測（End-point quantitative PCR detection），又分為終點酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和終點熒光定量（End-point Fluor-PCR）兩種。
第三代產品：
實時定量QPCR儀＋實時熒光定量試劑，構成QPCR-DAN/RNA實時熒光定量檢測。
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&?? ?問：相比以前的方法，QPCR有哪些特點？
答：QPCR至少有以下特點：
n??????? 所用儀器少，只用一臺儀器。
n??????? 檢測時間短，只須45分鐘～1小時10分鐘（試劑各異），而定性PCR須3～4小時，酶免終點定量須5～6小時，熒光終點定量須2～3小時。
n??????? 操作極其簡單：前處理后，樣本插入儀器一小時后到電腦上來出報告即可，無須開蓋，移樣本（以前方法），避免污染。
n??????? 結果精確：定性PCR只能定性，很粗略，終點定量PCR由于只能在40個熱循環結束后檢測熒光，被測熒光達到飽和導致定量不夠精確，屬于半定量狀態。而實時熒光QPCR是在擴增的每時每刻連續檢測各樣本的熒光值的變化，如圖一所示：
西安天隆TL
檢測動態范圍：100～1010? DNA copies/ml
檢測精度：0.1RLU
辨別率：5000和10,000個模板拷貝樣本的辨別率99.7％。
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&?? ?問：QPCR的技術先進性、價格及應用現狀？
答：實時熒光QPCR是當今世界用于臨床的最先進核酸分子診斷技術，被美國FDA承認并推崇，被美國FDA批準并取得臨床應用執照的QPCR試劑品種有：
HBV乙肝病毒DNA，
HCV丙肝病毒RNA，
HIV愛滋病病毒RNA，
Chlamydi trachomatis（CT），性傳播疾病，沙眼衣原體，
Neiserria gonorrhea (NG)，性傳播疾病，淋病雙球菌，
Cytomegalovirus（CMV），性傳播疾病，巨細胞病毒，
Mybobacterium tuberculosis（Mtb），呼吸道疾病，結核分支桿菌等。
實時熒光PCR儀研發技術難度大，門檻高，發達國家也只有有限幾家知名公司生產，且售價昂貴：如
羅氏公司的??????????? LightCycler 480
德國eppendorf 公司?? Mastercycler ep realplex 實時熒光定量PCR儀
BIO-RAD公司????????? iQ5實時PCR檢測系統
美國ABI????????????? 7500 Real-Time PCR System
美國ABI????????????? 7000 Sequence Detection System Spare Parts
美國ABI??????????? ??7900HT Fast Real-Time PCR System
以上產品價格在50萬上下不等。
可見，在病人看來，哪家醫院應用了QPCR技術便是先進診斷技術的象征，在發達國家也是如此。
國產儀器情況：
國產儀器生產單位不超過五家，其中包括：
日本獨資杭州博日實時熒光QPCR儀（33孔）
西安天隆科技有限公司實時熒光QPCR儀（48孔）
以上產品均取得國家SFDA認證，報價均在30萬以內。
國產試劑情況：
多家公司生產實時熒光QPCR試劑盒，價格與終點法試劑相當，且品種齊全，價格便宜，購買方便：
乙肝HBV-DNA，
丙肝HCV-RNA，
艾滋AIDS HIV-RNA，
性病系列：淋病雙球菌NG，?? 沙眼衣原體CT，
解脲支原體UU，?? 皰疹病毒HSV，
人體乳頭瘤HPV，
優生優育系列：巨細胞病毒CMV，弓形蟲COX等。
&?? 問：QPCR的應用領域
答：QPCR主要應用在醫療檢驗、疾病防控、食品安全、農業、林業、畜牧養殖、水產養殖、分子生物、法醫鑒定、科研探究等諸多領域。
據不完全統計相關國家標準強制要用QPCR儀進行檢測：
《2004GB/T 194380.1-禽流感病毒通用熒光 RT-PCR檢測方法》
《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法：熒光PCR方法》
《SN/T 1870-2007 食品中致病菌檢測方法：實時PCR法》
《GBT 21105-2007 動物源性飼料中狗源性成分定性檢測方法 PCR方方法》
《GBT 21102-2007 動物源性飼料中兔源性成分定性檢測方法 實時熒光PCR方法》
《GBT 19915.8-2005 豬鏈球菌2型毒力因子熒光PCR檢測方法》
《GBT 19495.4-2004 轉基因產品檢測 核酸定性PCR檢測方法》
《SNT 1686-2005 新城疫病毒中強毒株檢測方法 熒光RT-PCR法》
《SN 0169-1992 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》