1、如何選用特殊細胞系培養基？?
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始。?
2、何時須更換培養基？?
視細胞生長密度而定，?或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。?
3、可否使用與原先培養條件不同之培養基？?
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基，?若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基，?細胞大都無法立即適應，?造成細胞無法存活。?
4、可否使用與原先培養條件不同之血清種類？?
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，?在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。?
5、何謂FBS,?FCS,?CS,?HS???
FBS?(fetal?bovine?serum)?和 FCS?(fetal?calf?serum)?是相同的意思，?兩者都是指胎牛血清，?FCS?乃錯誤的使用字眼，?請不要再使用。 CS?(calf?serum)?則是指小牛血清。HS?(horseserum)?則是指馬血清。?
6、培養細胞時應使用5?%?或10%?CO2？或根本沒有影響？?
一 般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+?作為pH?的緩沖系統，?而培養基中NaHCO3?的含量將決定細胞培養時應使用的CO2?濃度。當培 養基中NaHCO3?含量為每公升3.7?g?時，細胞培養時應使用10?%?CO2；當培養基中NaHCO3?為每公升1.5?g?時，?則應使用 5?%?CO2?培養細胞。?
7、Hank's?平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank's?平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別？?
HBS 和?EBS?的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles?(2.2g/L)中比在Hanks?(0.35g/L)?中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2 平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2?中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組 織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。?
8、細胞之接種密度為何？?
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。?
9、懸浮性細胞應如何繼代處理？?
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，?稀釋細胞濃度即可，?若培養液太多時，?可將培養角瓶口端稍微抬高，?直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶，?加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，?重復前述步驟即可。?
10、冷凍管應如何解凍？?
取出冷凍管后，?須立即放入37?°C?水槽中快速解凍，?輕搖冷凍管使其在1?分鐘內全部融化，?并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，?否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，?必須注意安全，?預防冷凍管之爆裂。?
11、細胞冷凍管解凍培養時，?是否應馬上去除DMSO？?
除少數特別注明對DMSO?敏感之細胞外，?絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞)，?在解凍之后，?應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中，?待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO?即可，?如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。?
12、附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA?濃度？應如何處理？?
一般使用之trypsin-EDTA?濃度為0.05%?trypsin-0.53mMEDTA.4?Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，?保存于–20?°C，避免反復冷凍解凍造成trypsin?之活性降低，?并可減少污染之機
13、欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？?
欲回收動物細胞，?其離心速率一般為300xg?(約1,000rpm)，5?-?10?分鐘，?過高之轉速，?將造成細胞死亡。?
14、細胞冷凍培養基之成份為何？?
動 物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5?-?10?%DMSO?(dimethyl?sulfoxide)?和90?-?95?%?原來細胞生長用 之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO?稀釋時會放出大量熱能，?故不可將DMSO?直接加入細胞液中，?必須使用前先行配制完成。?
15、DMSO?之等級和無菌過濾之方式為何？?
冷 凍保存使用之DMSO?等級，?必須為Tissue?culture?grade之DMSO?(如Sigma?D2650)，?其本身即為無菌狀況，?第 一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，?保存于4°C，?避免反復冷凍解凍造成DMSO?之裂解而釋出有害物質，?并可減少污染之機會。若要過濾 DMSO，?則須使用耐DMSO?之Nylon?材質濾膜。?
16、冷凍保存細胞之方法？?
冷凍保存方法一:?冷凍管置于4?°C?30~60?分鐘→?(-20?°C30?分鐘*)?→?-80?°C?16~18?小時(或隔夜)?→?液氮槽vaporphase?長期儲存。?
冷 凍保存方法二:?冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3?°C?至–80?°C?以下，?再放入液氮槽vapor?phase長期儲 存。*-20?°C?不可超過1?小時，?以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C?冰箱中，惟存活率稍微?降低一些。?
17、細胞欲冷凍保存時，?細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？?
冷凍管內細胞數目一般為1x106?cells/ml?vial，?融合瘤細胞則以5x106?cells/ml?vial?為宜。?
18、培養基中是否須添加抗生素？?
除于特殊篩選系統中外，?一般正常培養狀態下，?培養基中不應添加任何抗生素。?
19、應如何避免細胞污染？?
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。?
20、如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？?
原則上：直接滅菌后丟棄之。?
當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。?
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。?
(1)在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。?
(2)分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0?mg/ml。?
(3)每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。?
(4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3代。?
(5)在無抗生素的培養基中培養細胞一代。?
(6)重復步驟4。?
(7)在無抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消除。?
21、支原體(mycoplasma)?污染的細胞，?是否能以肉眼觀察出異狀？?
不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，?無法以其外觀分辨之。?
22、支原體污染會對細胞培養有何影響？?
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數，?代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。?
23、偵測出細胞株有支原體污染時，?該如何處理？?
直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。?
24、CO2?培養箱之水盤如何保持清潔？?
定期(至少每兩周一次)?以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。?
25、為何培養基保存于4?°C?冰箱中，?顏色會偏暗紅色，?且pH值會越來越偏堿性？?
培 養基保存于4?°C?冰箱中，?培養基內之CO2?會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol?red)?的顏色 也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果，?將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，?可以通入無菌過濾之CO2，?以調整pH?值。?
26、各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？?
不同廠牌的dish?或flask，?其所coating?的polymer?不同，?制造程序亦不同，?雖對大部分細胞沒有太大之影響，?惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish?或flask?而有顯著之生長差異。?
27、購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？?
研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少，?大都是因為離心過程操作上的失誤，?造成細胞的物理性損傷，?以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，?應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。?
28、購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？?
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，?常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，?加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80?°C?太久。
29、L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？?
L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。?
30、GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？?
GlutaMAX-I?二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。?
GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I?二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。?
31、什么培養基中可以省去加酚紅？?
酚 紅在培養基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，(特別是雌激素)。為避免固醇類 反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。?
32、如何用臺盼蘭計數活細胞？?
用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色細胞是死細胞。?
33、培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？?
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。?
34、二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？?
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。?
35、室溫下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？?
緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM?Tris-HC?溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值。?
50mM?Tris-HC?溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值?
4°C??25°C???37°C?
8.1??????8.5??????7.2?
8.2??????7.6??????7.3?
8.3??????7.7??????7.4?
8.4??????7.8??????7.5??
8.5??????7.9??????7.6??
8.6??????8.0??????7.7?
8.7??????8.1??????7.8?
8.8??????8.2??????7.9?
8.9??????8.3??????8.0
9.0??????8.4??????8.1?
9.1??????8.5??????8.2?
9.2??????8.6??????8.3?
9.3??????8.7??????8.4?
9.4??????8.8???8.5
36、如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？?
我們推薦使用脫落細胞的方法，此技術破壞性最小，生活力最高。通過使用巴斯德吸液管，讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。?
37、胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：?
(1)去除培養基。?
(2)用2ml?1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞，去除PBS。?
(3)加入2ml?1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。?
(4)37?℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。?
(5)向細胞中加入2ml?細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。(培養基中的FBS終止了胰酶的活性。)?
(6)離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養基。?
(7)用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。?
38、在Sf9,?Sf21,?和high?Five細胞懸浮培養時，肝素的使用量是多少？?
為了防止懸浮培養細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。?
39、在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數的增加，它的感染能力會降低嗎？?
通常情況當細胞經過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候計數時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。?
40、貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基，在放置幾天后顏色變紫??
這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘，來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。?
41、細胞培養基偶然被凍，可否繼續使用？?
如果細胞培養基偶然被凍，您應該熔化培養基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生，培養基可以正常使用，如果出現沉淀，只能丟棄這些培養基。?
42、無血清培養與有血清培養使用的抗生素量一樣嗎？?
當在無血清培養基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。?
43、培養基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？?
一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。?
44、培養基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎？?
大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。?
45、為什么要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液??
胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩定。?
46、保存血清最好的方法??
我們建議血清應保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。?
47、如何解凍血清才不會使產品質量受損??
將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規則地搖晃均勻。?
48、血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理??
血清中沉淀物的出現有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。?
若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養基內一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜。?
49、為什么要熱滅活血清??
加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究，培養ES細胞、平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。?
50、有必要做熱滅活嗎??
實 驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫 處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常 會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。?
若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節省時間，更確保血清的質量!?
51、為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀??
有些胎牛血清產品沒有預老化，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。?
52、如何避免沉淀物的產生??
我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作:?
(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產生沉淀物。?
(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發生。?
(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。?
(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。?
(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。上海研卉生物科技有限公司提供