在細胞培養實驗中，我們有時候會遇到很多問題。為搶救細胞，就得對癥下藥！
只要抓住這5點，救細胞就是小case~

一、樣本本身
1.細胞衰老
2.個體差異（查看樣本初始檢測報告）
細胞自身問題
種子質量很重要
細胞在經過多次傳代之后，細胞擴增能力就會下降，可以重新復蘇更原始的細胞進行培養。
如果你使用的是凍存的細胞，那就有可能在凍存時該細胞的增殖能力就很弱了，可以通過查看以往的操作記錄來判斷。
還有一點就是個體差異，可以在培養前通過已知的標準對樣本進行篩選，從而減少個體差異帶來的影響。

二、外源污染
如果相同來源的其它批次的細胞并沒有出現問題，你就要思考一下你是不是“中獎了”。請及時對可疑細胞以及培養使用的試劑進行隔離。
細胞污染原因及解決方法：

細菌污染
細菌是一種原核細胞微生物，其大小以微米(μm)計。
常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。
一旦發生細菌污染較易發現，多數情況下培養液短期內顏色變黃，表明有大量酸性物質產生，出現明顯混濁現象；有時靜置的培養液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時可取少量培養液涂片染色檢查以證實細菌種類；有的培養液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可取10ml細胞懸液以100rpm離心5min，沉淀中加入無抗生素的培養液2ml，置于37℃培養，24h可得結果。
污染后細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。

解決方案：
(1) 丟棄所有已經污染的細胞和培養基；
(2) 培養環境用新潔爾滅擦拭且UV滅菌24小時；
(3) 培養試劑中加入P/S雙抗；
(4) 盡可能使用一次性耗材及成品培養基；

真菌污染
真菌污染是細胞培養過程中最常見的一種，尤其在梅雨季節進行細胞培養更易污染。
污染培養細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
霉菌污染后多數在培養液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發現，短期內培養液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養液中。鏡下看時，要將培養瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。
真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

解決方案：
(1) 丟棄所有已經污染的細胞和培養基；
(2) 培養環境用甲醛熏蒸；
(3) 培養試劑中加入兩性霉素B；
(4) 盡可能保持細胞培養環境的干燥；
(5) 注意戴帽子和口罩；
(6) 盡可能使用一次性耗材及成品培養基；

支原體污染
約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態呈高度多形性．可為圓形、絲狀或梨形。
支原體污染細胞后．培養液可不發生混濁．多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解．因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢．甚至從培養器皿脫落。

解決方案：
(1) 丟棄所有已經污染的細胞和培養基；
(2) 使用支原體清除試劑擦拭培養箱及超凈工作臺；
(3) 培養試劑中加入支原體清除試劑；
(4) 注意戴帽子和口罩；
(5) 盡可能使用一次性耗材及成品培養基；

黑膠蟲污染
黑膠蟲可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養液不渾濁，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養的細胞中發現類似現象。數量不多的時候對細胞生長狀態不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。

原蟲污染
培養液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多，輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態不好，邊緣不清楚，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養。

病毒污染
組織細胞培養過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產生病毒污染。

交叉污染
共用試劑、耗材，同時操作不同的樣本，都極易造成交叉污染。交叉污染之 | 王應該屬于HeLa細胞了，世界上已有很多細胞都受其污染，致使許多實驗宣告無效。

面對以上問題，我們技術員需要注意幾個方面，設備的潔凈度，試劑的選擇與儲存，耗材的選擇，操作方法。

三、試劑
在細胞培養實驗中，如果出現使用同批次試劑培養的細胞大部分都出現問題情況，就需要鎖定是否是試劑的問題導致的。
首先我們應該先要檢查試劑的規格、效價是否與之前一致，如果有改變則需根據情況修改加入的量；
然后我們要檢查試劑的品牌是否與之前一致，如果有更換應驗證該品牌是否能適用于這類細胞。
最后我們要檢查試劑的有效期是否過期、存放位置是否有問題、是否反復凍融等，以免試劑已因此而失效。
總的來說，就是要選對試劑、買真試劑、驗證好試劑、保存好試劑、正確使用試劑。

四、操作
嚴格按照SOP操作實驗，避免不必要的感染。輕吹打；掌握消化時間；及時觀察細胞培養情況，合理補換液；增殖緩慢時，控制好補液時間，添加血清，細胞生長因子。



五、耗材
選擇合適的一次性使用耗材，避免重復使用，確保培養瓶，培養皿等耗材是否可貼壁培養，選擇品牌耗材。
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