Calcein AM，中文名鈣黃綠素乙酰氧基甲酯，是一種可滲透進入細胞、常用于測定真核細胞活力或線粒體通透性轉換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的綠色熒光探針。Calcein AM近年來被廣泛應用到細胞活性分析實驗中。
Calcein AM (Calcein Acetoxymethyl Ester，中文名稱為鈣黃綠素AM或鈣黃綠素乙酰氧基甲酯)，是在Calcein (鈣黃綠素)的基礎上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基團，加強了疏水性，因此能夠輕易穿透活細胞膜。Calcein AM本身并無熒光，進入細胞后被細胞中內源性酯酶水解生成具有強負電荷的不能通透細胞膜的極性分子鈣黃綠素(Calcein)，從而被滯留在細胞內，而Calcein可發出強綠色熒光。與其它同類探針相比，由于Calcein AM的細胞毒性非常低，幾乎不會影響細胞功能如細胞增殖或淋巴細胞的趨化性等，而且對pH值敏感性低，所以Calcein AM是目前染活細胞的最理想熒光探針之一。
由于死細胞缺乏酯酶，Calcein AM僅用于對活細胞的活力測試和短期標記，而核酸紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)由于不能穿透活細胞的細胞膜而只能染色細胞膜完整性被破壞的死細胞，所以Calcein AM常常與碘化丙啶(ST511)聯合使用，對活細胞和死細胞同時進行雙重熒光染色。
Calcein AM可以應用于大多數的哺乳動物細胞。有報道稱Calcein AM也可以用于某些植物細胞如擬南芥(Arabidopsis)的根邊緣樣細胞(root border-like cells)及某些酵母如Pichia anomala和Saccharomyces cerevisiae。某些寄生蟲如Leishmania由于細胞膜組分的原因，Calcein AM不能進入活細胞，但卻可以進入凋亡早期的寄生蟲細胞，從而與PI聯用用于檢測凋亡早期的寄生蟲。由于真菌和細菌有細胞壁，會阻礙Calcein進入細胞，因此Calcein AM不適合用于真菌和細菌。
Calcein本身是一種金屬絡合指示劑，在生理pH條件下和Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+等金屬離子絡合時，熒光信號會發生淬滅。Calcein AM及其水解產物Calcein的分子結構式參考圖1。
圖1. Calcein AM及其水解產物Calcein的分子結構式。
Calcein AM分子式為C46H46N2O23，分子量為994.86，CAS號為148504-34-1。水解產物Calcein的最大激發光波長為494nm，最大發射光波長為514nm。Calcein的激發光譜和發射光譜參考圖2。
圖2. Calcein的激發光譜和發射光譜。
本Calcein AM純度高，>95.5%，溶解在無水DMSO中，濃度為2mM。Calcein AM的常用終濃度為0.1-5μM，為得到比較理想的結果，請根據細胞類型和實驗實際情況對Calcein的最終濃度進行適當調整。
按Calcein AM最終工作濃度為0.1-5μM計算，本產品2mM×0.1ml包裝可以配制40-2000ml的染色工作液，2mM×0.5ml包裝可以配制0.2-10L的染色工作液。
包裝清單：
| 產品編號 | 產品名稱 | 包裝 |
| C2012-0.1ml | Calcein AM (鈣黃綠素AM) | 2mM×0.1ml |
| C2012-0.5ml | Calcein AM (鈣黃綠素AM) | 2mM×0.5ml |
| － | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃避光保存，一年有效。
注意事項：
熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
Calcein AM在潮濕環境中容易分解，并避免反復凍融，收到產品后建議分裝并-20℃密封保存。
由于Calcein AM在PBS等水溶液中不穩定，配制成工作液后需盡快使用。
培養液中的血清和酚紅對Calcein AM的染色有一定的影響，建議在加入Calcein AM工作液前充分洗滌細胞。
Calcein AM標記的細胞，熒光均勻，而且對短期細胞遷移示蹤效果非常好，但熒光的持續時間與細胞類型、培養條件等因素相關，一般在幾小時之內，而且有時也會被某些類型細胞迅速外排。如果需要長時間標記細胞，請使用CFDA SE (C1031)等熒光探針。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.Calcein AM染色工作液的配制：
用合適的緩沖液，如無血清培養液、HBSS (C0218)或PBS (C0221A/C0221D)稀釋2mM的本產品，配制成濃度為0.1-5μM的Calcein AM染色工作液。
注：Calcein AM的最終濃度建議根據細胞類型和實驗實際情況進行適當調整。
2.懸浮細胞的熒光顯微鏡檢測或熒光酶標儀檢測：
a.細胞按實驗設計進行一定處理后，計數。取適當細胞250×g室溫離心5min，棄上清，加入適當體積的Calcein AM染色工作液使細胞密度約為1×106/ml。
b.37℃孵育細胞30-45min，不同的細胞最佳孵育時間不同。可以考慮以30min作為初始孵育時間，根據具體的實驗情況進行適當優化得到更加理想的檢測效果。
c.孵育結束后，250×g離心5min，吸除上清液，緩慢加入37℃預熱的培養液重懸細胞。
d.重復步驟c兩次或以上以充分洗滌去除殘留的染色液。
e.更換新鮮的37℃預熱的培養液，37℃再避光孵育30分鐘，以保證細胞內酯酶充分水解Calcein AM以生成有綠色熒光的Calcein。
f.250×g室溫離心5min，吸除大部分培養液，用剩余培養液將細胞重懸后涂片，在熒光顯微鏡下觀察或熒光酶標儀檢測。Calcein的最大激發光波長為494nm，最大發射光波長為514nm。如有需要，也可進行進一步進行其它熒光的復染，例如使用Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或Propidium Iodide/碘化丙啶(ST511)檢測細胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細胞核等。注意整個過程均需避光操作。
3.貼壁細胞的熒光顯微鏡檢測或熒光酶標儀檢測：
a.將細胞接種于培養皿、多孔細胞培養板或者細胞爬片上，按實驗設計對細胞進行一定處理。
b.吸除培養液，用PBS清洗細胞1-2遍。
c.加入適當體積的Calcein AM染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。一般96孔板每孔體積為100μl，24孔板每孔體積為250μl，12孔板每孔體積為500μl，6孔板每孔體積為1ml。
d.37℃避光孵育30-45min，不同的細胞最佳孵育時間有所不同。以30min作為初始孵育時間，根據所用細胞對孵育時間進行適當優化以得到更加理想的染色效果。
e.孵育結束后，更換成新鮮的37℃預熱的培養液，37℃再避光孵育30min，以保證細胞內酯酶充分水解Calcein AM以生成有綠色熒光的Calcein。
f.吸除培養液，用PBS清洗2-3次，然后加入無血清細胞培養液后即可在熒光顯微鏡下觀察或熒光酶標儀檢測。Calcein的最大激發光波長為494nm，最大發射光波長為514nm。如有需要，也可進一步進行其它熒光的復染。例如使用Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或Propidium Iodide/碘化丙啶(ST511)檢測細胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細胞核等。注意整個過程均需避光操作。
4.流式細胞儀檢測：
a.貼壁細胞胰酶消化后用培養液重懸，懸浮細胞直接使用，計數，取適量細胞250×g室溫離心5min，棄上清，加入適當體積的Calcein AM染色工作液，使細胞為單細胞懸液，并且細胞密度為約1×106/ml，每個樣品體積為1ml。注：需要準備好僅含緩沖液的細胞樣品用作流式細胞儀檢測時的陰性對照，該緩沖液與配制Calcein AM染色工作液的緩沖液宜保持一致。
b.37℃避光孵育30min。
c.孵育完成后，250×g室溫離心5min收集細胞。每個樣品加入1ml緩沖液，輕輕重懸，250×g室溫離心5min收集細胞。注：本步驟可去除多余染料及可能引起熒光淬滅的試劑。
d.用400μl緩沖液重懸細胞。如有需要，也可進行進一步染色。例如使用Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或Propidium Iodide/碘化丙啶(ST511)檢測細胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細胞核等。注意整個過程均需避光操作。染色后，將樣品置于冰上，可以在1小時內進行流式細胞儀檢測和分析。
e.注意使用僅含緩沖液的并且未經染色的細胞樣品用于流式細胞儀的陰性對照設置。Calcein的最大激發光波長為494nm，最大發射光波長為514nm。?