人膠原蛋白α1 Elisa試劑盒
產品編號：SEKH-0401
適用于人血清、血漿或細胞培養上清液等樣本
背景介紹：
? ? ? ?膠原是動物體內含量最豐富的蛋白質，約占人體蛋白質總量的30％以上。它遍布于體內各種器官和組織，是細胞外基質中的框架結構，可由成纖維細胞、軟骨細胞、成骨細胞及某些上皮細胞合成并分泌到細胞外。目前已發現的膠原至少有19種，由不同的結構基因編碼，具有不同的化學結構及免疫學特性。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ及Ⅺ型膠原為有橫紋的纖維形膠原。Ⅰ型膠原的原纖維平行排列成較粗大的束，成為光鏡下可見的膠原纖維，抗張強度超過鋼筋。其三股螺旋由二條α1（Ⅰ）鏈及一條α2（Ⅰ）鏈構成。每條α鏈約含1050個氨基酸殘基，由重復的Gly-X-Y序列構成。X常為Pro（脯氨酸），Y常為羥脯氨酸或羥賴氨酸殘基。重復的Gly-X-Y序列使α鏈卷曲為左手螺旋，每圈含3個氨基酸殘基。三股這樣的螺旋再相互盤繞成右手超螺旋，即原膠原。人α1（Ⅰ）鏈的基因含51個外顯子，因而基因轉錄后的拼接十分復雜。翻譯出的肽鏈稱為前α鏈，其兩端各具有一段不含Gly-X-Y序列的前肽。三條前α鏈的C端前肽借二硫鍵形成鏈間交聯，使三條前α鏈“對齊”排列。然后從C端向N端形成三股螺旋結構。前肽部分則呈非螺旋卷曲。帶有前肽的三股螺旋膠原分子稱為前膠原（procollagen）。膠原變性后不能自然復性重新形成三股螺旋結構，原因是成熟膠原分子的肽鏈不含前肽，故而不能再進行“對齊”排列。
檢測原理：
? ? ? ?Solarbio ELISA試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯免疫吸附檢測技術。將抗人Collagen Ⅰ α1單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預稀釋的樣本，標準品和樣本中的人Collagen Ⅰ α1會與酶標板上的包被抗體充分結合；洗板后加入生物素化抗人Collagen Ⅰ α1抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的人Collagen Ⅰ α1發生特異性結合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發生高強度的非共價結合；洗板后加入顯色劑底物TMB，若反應孔中樣品存在不同濃度的人Collagen Ⅰ α1，則HRP會使無色TMB變成不同深淺（正相關）的藍色物質，加入終止液后反應孔會變成黃色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應孔樣品吸光度（OD），樣本中的人Collagen Ⅰ α1濃度與OD成正比，通過繪制標準曲線和四參數擬合軟件便可計算出樣本中人Collagen Ⅰ α1的濃度。
原理圖：
注意事項：
1.試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2.試劑盒未使用時應保存在2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3.試劑盒使用前請在室溫恢復30min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4.在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持一致。
5.為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
6.濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7.除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8.為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線。
安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關管理規定執行。
試劑盒組成及儲存：
自備實驗器材（不提供，可代購）
1．酶標儀（主波長450nm，參考波長630nm）
2．高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3．洗板機或洗瓶
4．37℃孵育箱
5．雙蒸水，去離子水，量筒等
6．稀釋用聚丙烯試管
樣本收集及儲存：
1.細胞培養上清：
將細胞培養基移至無菌離心管，在4℃條件下1000 ×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），避免反復凍融。
2.血清樣本：
室溫血液自然凝固20 min后，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3.血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合20 min，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的最高值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。
試劑準備：
1.試劑回溫：首先在實驗前30 min將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2.配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存。
3.標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標準品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度進行2倍稀釋： 2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、pg/ml進行稀釋，2000pg/ml為標準曲線最高點濃度，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點（0pg/ml）。復溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
4.生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內加入到反應孔中。
5.酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內使用。
6.洗滌方法：
自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為300ul/孔，注與吸出間隔為30秒，洗板5次。
手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔，靜止30秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板5次。
檢測步驟：
結果判斷：
1.用酶標儀450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的OD測定值減去630 nm的OD測定值。
2.計算標準品、樣品的平均OD值：每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值。
3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中Collagen Ⅰ α1含量可通過對應OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
4.若標本OD值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數。
參數表征：
1. 數據及標準曲線
本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人Collagen Ⅰ α1的樣本含量。
2. 靈敏度：
最低可檢測人Collagen Ⅰ α1濃度達16pg/ml，
20個零標準品濃度OD的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度。
3. 特異性：
不與人BMP-1，Collagen II，Collagen III α1，Collagen XXIII α1，Mrc2等反應。
4. 重復性：
板內，板間變異系數<10%。
5. 回收率：
在選取的健康人血漿、細胞培養上清中加入 3 個不同濃度水平的人Collagen Ⅰ α1，計算回收率。
6. 線性稀釋：
分別在選取的4份健康人血漿和細胞培養上清中加入高濃度人Collagen Ⅰ α1，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。
? ? ? ?膠原是動物體內含量最豐富的蛋白質，約占人體蛋白質總量的30％以上。它遍布于體內各種器官和組織，是細胞外基質中的框架結構，可由成纖維細胞、軟骨細胞、成骨細胞及某些上皮細胞合成并分泌到細胞外。目前已發現的膠原至少有19種，由不同的結構基因編碼，具有不同的化學結構及免疫學特性。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ及Ⅺ型膠原為有橫紋的纖維形膠原。Ⅰ型膠原的原纖維平行排列成較粗大的束，成為光鏡下可見的膠原纖維，抗張強度超過鋼筋。其三股螺旋由二條α1（Ⅰ）鏈及一條α2（Ⅰ）鏈構成。每條α鏈約含1050個氨基酸殘基，由重復的Gly-X-Y序列構成。X常為Pro（脯氨酸），Y常為羥脯氨酸或羥賴氨酸殘基。重復的Gly-X-Y序列使α鏈卷曲為左手螺旋，每圈含3個氨基酸殘基。三股這樣的螺旋再相互盤繞成右手超螺旋，即原膠原。人α1（Ⅰ）鏈的基因含51個外顯子，因而基因轉錄后的拼接十分復雜。翻譯出的肽鏈稱為前α鏈，其兩端各具有一段不含Gly-X-Y序列的前肽。三條前α鏈的C端前肽借二硫鍵形成鏈間交聯，使三條前α鏈“對齊”排列。然后從C端向N端形成三股螺旋結構。前肽部分則呈非螺旋卷曲。帶有前肽的三股螺旋膠原分子稱為前膠原（procollagen）。膠原變性后不能自然復性重新形成三股螺旋結構，原因是成熟膠原分子的肽鏈不含前肽，故而不能再進行“對齊”排列。
檢測原理：
? ? ? ?Solarbio ELISA試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯免疫吸附檢測技術。將抗人Collagen Ⅰ α1單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預稀釋的樣本，標準品和樣本中的人Collagen Ⅰ α1會與酶標板上的包被抗體充分結合；洗板后加入生物素化抗人Collagen Ⅰ α1抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的人Collagen Ⅰ α1發生特異性結合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發生高強度的非共價結合；洗板后加入顯色劑底物TMB，若反應孔中樣品存在不同濃度的人Collagen Ⅰ α1，則HRP會使無色TMB變成不同深淺（正相關）的藍色物質，加入終止液后反應孔會變成黃色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應孔樣品吸光度（OD），樣本中的人Collagen Ⅰ α1濃度與OD成正比，通過繪制標準曲線和四參數擬合軟件便可計算出樣本中人Collagen Ⅰ α1的濃度。
原理圖：
注意事項：
1.試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2.試劑盒未使用時應保存在2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3.試劑盒使用前請在室溫恢復30min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4.在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持一致。
5.為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
6.濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7.除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8.為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線。
安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關管理規定執行。
試劑盒組成及儲存：
自備實驗器材（不提供，可代購）
1．酶標儀（主波長450nm，參考波長630nm）
2．高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3．洗板機或洗瓶
4．37℃孵育箱
5．雙蒸水，去離子水，量筒等
6．稀釋用聚丙烯試管
樣本收集及儲存：
1.細胞培養上清：
將細胞培養基移至無菌離心管，在4℃條件下1000 ×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），避免反復凍融。
2.血清樣本：
室溫血液自然凝固20 min后，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3.血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合20 min，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的最高值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。
試劑準備：
1.試劑回溫：首先在實驗前30 min將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2.配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存。
3.標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標準品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度進行2倍稀釋： 2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、pg/ml進行稀釋，2000pg/ml為標準曲線最高點濃度，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點（0pg/ml）。復溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
4.生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內加入到反應孔中。
5.酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內使用。
6.洗滌方法：
自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為300ul/孔，注與吸出間隔為30秒，洗板5次。
手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔，靜止30秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板5次。
檢測步驟：
結果判斷：
1.用酶標儀450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的OD測定值減去630 nm的OD測定值。
2.計算標準品、樣品的平均OD值：每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值。
3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中Collagen Ⅰ α1含量可通過對應OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
4.若標本OD值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數。
參數表征：
1. 數據及標準曲線
本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算人Collagen Ⅰ α1的樣本含量。
2. 靈敏度：
最低可檢測人Collagen Ⅰ α1濃度達16pg/ml，
20個零標準品濃度OD的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度。
3. 特異性：
不與人BMP-1，Collagen II，Collagen III α1，Collagen XXIII α1，Mrc2等反應。
4. 重復性：
板內，板間變異系數<10%。
5. 回收率：
在選取的健康人血漿、細胞培養上清中加入 3 個不同濃度水平的人Collagen Ⅰ α1，計算回收率。
6. 線性稀釋：
分別在選取的4份健康人血漿和細胞培養上清中加入高濃度人Collagen Ⅰ α1，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。