基因組編輯（Genome Editing）又稱基因編輯，是基因工程的一種，指在活體基因組中進行DNA插入、刪除、修改或替換的一項技術。其中，CRISPR/Cas9技術是目前基因編輯領域內應用最廣的技術，該項技術一經誕生就被人們視為21世紀最為重要的生物發現之一。它穩定高效，已經被全球各地的研究人員應用在各種生物的基因修復、基因改造等技術中。

然而，這一技術從被發現到被廣泛應用還不到10年時間。

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什么是CRISPR/Cas？

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 規律間隔成簇短回文重復序列)，是存在于細菌和古菌基因組內的?段重復序列。

Cas (CRISPR-associated, CRISPR關聯）蛋?，由總是出現在CRISPR區域附近的CRISPR關聯基因編碼的蛋白。Cas9是其中一種核酸內切酶，即能從核酸的內部切開雙鏈的酶。

在自然界中，CRISPR/Cas系統能為細菌和古?菌提供對病毒和質粒的適應性免疫?，F在，科學家通過對這個系統的重新設計和編程，可以精確識別并切斷目標DNA，并誘導細胞進行DNA修復，最終實現基因敲除和基因修改。

細菌的CRISPR。鉆石是“重復序列”，正方形是重復序列之間的“間隔成簇”，鉆石與正方形有“規律”地在染色體內密集出現，而不是隨機分布。
（圖片來自《破天機——基因編輯及其控制演化的驚人力量》）

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“發現”的歷程

—— 1987年，這種特殊的重復序列被?次描述。?本大阪大學的科學家?野良純發現?腸桿菌基因組DNA上有?段重復結構：有?段29堿基的序列反復出現了5次，兩兩之間都被32個堿基形成的看起來雜亂?章的序列隔開。

—— 1993，西班牙科學家Francisco Mojica在其他細菌和古菌中發現相似的重復序列，并將其命名為SRSR (Short Regularly Spaced Repeats, 短間隔重復序列)。
—— 2002年，Ruud Jansen及他的同事首次在印刷品中使用CRISPR一詞。他們還發現這些序列一般可以在CRISPR相關基因，即Cas基因旁邊找到，而Cas基因所編碼的蛋白質結構與那些能與DNA發生相互作用的酶的結構很相似。因此，他們推測Cas基因與CRISPR序列存在“功能上的關系”，但這種關系的作用還不清楚。

• 病毒DNA?段夾在細菌的重復結構中，就像是細菌在基因組?收藏了病毒不同?度的快照。憑什么僅靠記錄?張病毒的快照，細菌就能夠防御未來的病毒入侵呢？
• 現在我們知道，細菌在遭到病毒?侵后，能夠把病毒基因的??段存儲到??DNA中的CRISPR序列。當再次遇到病毒?侵時，細菌能夠根據存寫的?段識別病毒，將病毒的DNA切斷?使之失效。

—— 從1993年到2005年間，Mojica發現，夾在重復序列之間的間隔序列與許多噬菌體（專門?侵細菌的病毒）的基因組序列信息?度?致，提出了CRISPR是細菌的?種適應性免疫機制的假設。
—— 2007年，在丹麥丹尼斯克公司（Danisco，世界知名的食品添加劑生產商）?作的科學家Rodolphe Barrangou及其團隊證明，在嗜熱鏈球菌（?產酸奶必須的?種益生菌）中??添加?段CRISPR序列，可以幫助細菌抵擋某種對應病毒的?侵。這是首次通過實驗證明CRISPR的功能與抵抗噬菌體感染有關。他們還發現，對于嗜熱鏈球菌而言，Cas基因控制了間隔序列的獲取與整合，而間隔序列可以特異性地靶向識別再次侵染的噬菌體基因組，因此，他們猜想Cas基因在CRISPR實現的免疫過程中起著重要作用，但其中細節尚不清楚。2008年，荷蘭科學家John van der Oost的團隊通過在大腸桿菌中的實驗證實，小RNA分子協助了細菌抗病毒反應中的識別和摧毀過程，他們稱之為CRISPR RNA (crRNA)。同時，他們還通過人為設計相應的crRNA序列使細菌獲得了抵抗噬菌體的特性，這是人類首次編輯CRISPR系統。

• CRISPR的RNA分子如何在細胞內產生，并從長鏈RNA轉化成更短的、只包含單一病毒配對RNA的片段？
• 細菌細胞把整個CRISPR序列翻譯成一條長RNA鏈，一種酶把它切成更短的RNA鏈，它們長度一致，但間隔序列不同。這個過程把DNA中較長的重復序列變成了更短的RNA分子文庫，每一個RNA分子都包含一段特定的噬菌體序列。

—— 2008年，美國伊利諾伊州西北?學的科學家Luciano Marraffni和Erik Sontheime證明了CRISPR的RNA分子的作?對象是DNA??RNA，它們是通過堿基配對靶向剪切入侵病毒的DNA。
—— 2010年12月，加拿大拉瓦爾大學的Sylvain Moineau的研究證明了，嗜熱鏈球菌CRISPR/Cas系統靶向鎖定噬菌體DNA后，在目標DNA的精確位置，即PAM上游的3個核苷酸處產生雙鏈斷裂（double strand break, DSB）。

• 什么是PAM，PAM在CRISPR/Cas系統中起到什么作用？
• PAM（Protospacer Adjacent Motif）是入侵病毒的一部分，但不在細菌CRISPR中出現。如果目標DNA序列后面沒有PAM序列，Cas9將不能對目標DNA進行干擾。PAM對靶向識別起著重要作用，它能幫助區分細菌自身和非自身DNA，從而防止細菌本身被CRISPR相關核酸酶鎖定和破壞。

—— 2011年3月，瑞典于默奧?學的法國科學家Emmanuelle Charpentier領導的實驗室在發現，除了crRNA外，還存在第?個RNA分子，他們稱之為trans-activating crRNA (tracrRNA)。在化膿鏈球菌中，tracrRNA對于病毒的失活是必需的。tracrRNA與crRNA形成雙鏈體，將Cas9蛋白（當時被稱為Csn1蛋白）引導?其靶標。
—— 2011年8月，立陶宛維爾紐斯大學的科學家Virginijus Siksnys和丹麥丹尼斯克公司的科學家，在大腸桿菌中重組了嗜熱鏈球菌的CRISPR系統，這種重建的CRISPR系統仍然可以實現對噬菌體DNA的靶向干擾。此外，他們還證明了，對于嗜熱鏈球菌對應的CRISPR/Cas系統而言，Cas9核酸酶是是實現干擾所需要的唯/一蛋白質，這是II類CRISPR系統的顯著特征（I類CRISPR/Cas系統中，RNA與多個Cas蛋白結合，形成識別和切割DNA的分子復合體；II類CRISPR/Cas系統則是由單個效應Cas蛋白來發揮功能）。

至此，細菌CRISPR/Cas9系統切割噬菌體DNA的三個核心要件：Cas9、crRNA和tracrRNA皆被發現。

（圖片來自《破天機——基因編輯及其控制演化的驚人力量》）

—— 2012年6?28日，美國加州?學伯克利分校的科學家Jennifer Doudna和瑞典于默奧?學的科學家Emmanuelle Charpentier領銜的研究團隊合作在Science雜志發表論?（2012年6月8日投稿），他們通過體外試驗證明，crRNA通過堿基互補配對與tracrRNA形成特殊的雙鏈RNA結構，指導Cas9在靶標DNA上引起雙鏈斷裂。團隊還將系統所需的兩條RNA融合改造成?條更加易?的單鏈向導RNA (single-guide RNA, sgRNA)，并證明了??設計的向導RNA同樣可以指導Cas9蛋?切割任意指定的?段DNA序列。

2020年10月，這兩位科學家被授予2020年諾貝爾化學獎，以表彰她們對“基因剪刀”CRISPR/Cas9的貢獻。
（圖片來自 nobelprize.org）

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參考文獻

1.王立銘. 上帝的手術刀——基因編輯簡史[M]. 浙江: 浙江人民出版社, 2017.

2.[美] 詹尼佛·A.杜德娜、[美]塞繆爾·H·斯坦伯格. 破天機——基因編輯及其控制演化的驚人力量[M]. 湖南: 湖南科學技術出版社, 2020.

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