一、實驗器材及試劑
1、 實驗器材
|
載玻片及蓋玻片 |
江蘇世泰實驗器材有限公司 |
|
顯微鏡 |
奧林巴斯 BX53 熒光顯微鏡 |
2、 主要實驗試劑
|
試劑 |
廠家 |
貨號 |
|
多聚甲醛 |
國藥集團 |
80096618 |
|
濃縮型正常山羊血清（封閉） |
武漢博士德生物工程有限公司 |
AR1009 |
|
熒光（Cy3）標記羊抗小鼠 IgG |
武漢博士德生物工程有限公司 |
BA1031 |
|
TritonX-100 |
碧云天 |
ST795 |
|
DAPI |
碧云天 |
C1002 |
|
抗熒光淬滅封片劑 |
SouthernBiotech |
0100-01 |
|
α-Sarcomeric actin（種屬:小鼠） |
武漢博士德生物工程有限公司 |
BM0001 |
二、細胞爬片免疫熒光實驗步驟
第一天：
1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3min；
2. 用 4%的多聚甲醛固定爬片 15min，PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3min；
3. 0.5% TritonX-100（PBS 配制）室溫通透 20min；
4. PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3min，吸水紙吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉 30min；
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗（α-Sarcomeric actin）
并放入濕盒，4℃孵育過夜；
第二天：
6. 加熒光二抗：PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋 好的熒光（Cy3）標記羊抗小鼠 IgG，濕盒中 20-37℃孵育 1h，PBST 浸洗切片 3 次，每次 3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
7. 復染核：滴加 DAPI 避光孵育 5min，對標本進行染核，PBST 5min×4 次洗去多余的 DAPI；
8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
