?使用串聯切向流過濾高效濃縮慢病毒載體
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簡介
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VSV-G-假型自我滅活慢病毒載體是不可或缺的生物實驗工具之一，與之前的γ-逆轉錄病毒載體不同的是，慢病毒載體可轉導非分裂細胞，并可攜帶更多的轉基因盒，在細胞中的轉基因表達時間也更長，即可獲得更高的滴度，而其遺傳毒性相對較低。
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一般情況下產毒細胞上清液中的載體滴度足以轉導常規細胞系，但原代細胞較難轉導，需要進行載體濃縮以獲得較高濃度。此外，一些載體因整合了會降低滴度的遺傳元件，且大多數細胞類型也不耐受產毒細胞生長培養基或其分泌蛋白，所以濃縮及清洗是慢病毒載體使用的必要步驟。
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超速離心是病毒顆粒濃縮的常用方法之一，但其濃縮系數較低，每次處理量也偏小，且繁瑣的多步操作會降低病毒顆粒回收率。離心過濾是相對較簡單的濃縮方法，但過濾器本身會捕獲截留大量載體，造成損耗。相較而言，切向流過濾（TFF）操作簡單，損耗低，且可通過洗濾過程有效降低產毒細胞代謝物及分泌蛋白，但傳統的一步式TFF濃縮程度僅可達50-100倍，本實驗使用兩步TFF，成功將5.5L 慢病毒載體原液濃縮至1mL左右，且回收率高達97%以上。而對終產物的質量分析顯示，濃縮的慢病毒載體可有效轉導原代人CD34+造血干/祖細胞和原代人纖維母細胞，且無明顯毒性。
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實驗
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實驗使用含pCCL載體質粒、gag/pol表達質粒及囊膜表達質粒pMD.G（VSV-G）的轉染混合液轉染293T細胞，并于轉染后進行丁酸鈉誘導，培養一定時間后，分兩次回收含LV培養基，過0.8μm過濾器，濾液保存于無菌容器。
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切向流過濾使用仕必純KrosFlo研發用IIi切向流過濾系統（產品編號：SYR2-U20-01N），第一步操作時，系統配用流路1（FP1，產品編號：EZ-M1-500S-260-01N-1，含500kD中空纖維過濾器（纖維數量320，纖維內徑0.5mm，膜表面積615cm2）），第二步操作時，系統配用流路2（FP2，產品編號：EZ-CHIL07-01-1，含500kD中空纖維過濾器（纖維數量12，纖維內徑0.5mm，膜表面積40cm2）。
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過濾前先檢查流路（FP1）完整性，用DPBS完全潤濕流路后，運行系統，直到DPBS排干，關閉端口和閥門，運行泵，直到入口壓力達到5psi左右，打開濾液端口，由于空氣不能滲過潤濕的過濾器纖維，如組件完整，則壓力降不應超過0.01psi/s。
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通過完整性測試后，開始濃縮含LV培養基。整個過程中，監測入口壓力，并維持為6psi以下。第一步操作可將5.5L料液濃縮至50mL，即濃縮100倍左右。濃縮的載體再用1000mL含胎牛血清的洗濾緩沖液進行恒量洗濾。之后，將系統流路更換為FP2，通過完整性測試后，將第一步獲得的50mL濃縮液進一步濃縮至1mL，即總濃縮達5000倍。該步入口壓力維持為9psi以下。
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隨后，通過HT-29細胞載體轉導實驗確認滴度，并使用多重實時PCR技術進行絕對定量分析。同時，以終濃度載體轉導原代人CD34+造血干/祖細胞，確認濃縮后載體的轉導效力。此外，構建針對誘導多能性干細胞（iPSC）生成的復合STEMCCA 載體，以相同的方法進行濃縮，檢測其轉導和重編程原代人纖維母細胞的能力。
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結果
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使用TFF進行LV濃縮可獲得極高的濃縮系數和回收率，且對濃縮后LV的凍融實驗顯示，終產物具有良好的穩定性。
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為測試濃縮LV的質量，進行了原代人CD34+造血干/祖細胞的轉導實驗，結果顯示，轉導非常成功，且隨載體濃度的增加，轉導成功率亦明顯上升，而無明顯毒性。而在原代人纖維母細胞轉導實驗中，含有高效STEMCCA元件的載體可有效轉導并重編程原代人纖維母細胞，形成誘導多能性干細胞，且成功率隨載體濃度增加而提高。
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討論
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使用兩步切向流過濾可以高倍數、高回收率地濃縮LV，工藝穩定，重復性好。針對CD34+的轉導和表達實驗表明濃縮后產物無明顯毒性，而高濃度STEMCCA載體制備及誘導實驗證明，該工藝可用于大規模復雜載體的生產和濃縮。
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問題解答 |
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問題 |
解決方案 |
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過濾器完整性測試失敗 |
更換過濾器 |
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流路泄漏 |
檢查流路所有連接，如有松動，則擰緊 |
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過濾器阻塞 |
如含LV培養基中有過多的顆粒或蛋白質（血清），則過濾器可能會阻塞。可使用無血清培養基，以降低含LV培養基中的蛋白質含量。如使用無血清培養基，而濾液流速降低，可關閉濾液端口，增加過濾器內部壓力，以疏通堵塞膜孔 |
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入口壓力過高 |
降低背壓，并降低流速 |
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聚集 |
如果蛋白質清除較多，可能會導致聚集增加。可在洗濾緩沖液中保留部分蛋白質，避免使用純DPBS進行洗濾 |
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過熱 |
FP2在使用時可能會變熱，影響載體穩定性。可將樣品容器及管路置于冰上進行操作。 |
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技術比較 |
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其它濃縮技術 |
優勢 |
劣勢 |
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超速離心 |
原理簡單，大分子或顆粒等共濃縮成分較少 |
無法達到高濃縮倍數，有污染風險，操作繁瑣，較難進行大規模處理 |
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超濾 |
操作相對簡單，可進行中等規模以上的處理 |
無法達到高濃縮倍數，有污染風險，過濾器截留大量載體造成損耗，負電荷物質形成共濃縮 |
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層析 |
無需特殊設備，大分子或顆粒等共濃縮成分較少 |
進行大規模處理非常困難且繁瑣 |
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參考文獻：
Cooper,A.R., Patel,S., Senadheera,S., et al., Highly efficient large-scale vector concentration by tandem tangential flow filtration. Journal of Virological Methods, 2011, 177: 1-9.
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