大鼠血管內皮細胞

大鼠

3-4h

Ⅷ因子相關抗原

IHC/IF

大鼠膀胱逼尿肌細胞

大鼠

3-4h

α-SM-Actin

IHC/IF

大鼠心肌細胞

大鼠

4-5h

α-actin

IHC/IF

大鼠心肌成纖維細胞

大鼠

3-4h

a-SA抗體

IHC/IF

小鼠血管平滑肌細胞

小鼠

3-4h

肌動蛋白α-SMA

IHC/IF

大鼠牙源性間充質細胞

大鼠

3-4h

波形絲蛋白（vimentin）
角蛋白（keratin）

IHC/IF

小鼠脾臟淋巴細胞

小鼠

小鼠巨噬細胞

小鼠

小鼠附睪精子細胞

小鼠

老年鼠脂肪間充質干細胞

老年鼠

3-4h

D44⁺CD45^-

流式表面抗原檢測

瘢痕組織成纖維細胞

瘢痕組織

3-4h

波形蛋白

IHC/IF

大鼠皮層神經元干細胞^﹡

大鼠

3-4h

Nestin

IHC/IF

骨髓源性內皮祖細胞（EPCs）^﹡﹡

骨髓

3-4h

CD34與CD133

IHC/IF

﹡：神經元干細胞原代培養通常需要額外的細胞因子如B-27、EGF、bFGF

﹡﹡：EPCs原代培養需要特殊培養基

威斯騰原代細胞培養和細胞藥篩

威斯騰生物經過10多年的發展，獲得了上百種細胞株和四十余鐘原代細胞培養經驗，并建立了龐大的細胞庫及原代培養資料庫；細胞平臺有資深實驗員、規范的SOP操作文件，萬級凈化細胞房，這些條件為保質保量完成每個客戶的實驗提供了保障。

同時，威斯騰生物結合多年原代及傳代細胞培養經驗，結合平臺已有的技術優勢，建立了完善的體外藥篩實驗，并引進RTCA（Real-time cellular Analysis，實時無標記細胞記錄儀），在藥篩過程中，全程實時記錄細胞真實狀況，為藥篩提供最真實精準的實驗數據。

威斯騰生物與上海中科院生物與細胞所化學生物學技術平臺合作，享有英國國家醫學研究院科技轉化部MRCT獨家提供的約1萬種核心結構小分子化合物庫資源，基于成藥性結構設計，特別適于進行以新藥研發為目的的活性化合物篩選。精選SiRNA庫，包含20個亞庫，可根據需求定制提高通路篩選。

原代細胞培養經典案例

1、淋巴細胞的原代培養

淋巴細胞主要來源：脾臟、外周血

分離方法：Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度離心法，因為血液中各成分的比重存在差異，因此得以分離。

分離效果：單個核細胞純度可達95％，淋巴細胞約占90％～95％，細胞獲得率可達80％以上，其高低與室溫有關，超過25℃時會影響細胞獲得率。

步驟：

1）眼球取血，將血液滴入肝素抗凝管中，加入PBS按1：1稀釋血液（一般采血管2mL+2mL）。

2）取淋巴細胞分離液2mL于15mL滅菌離心管中待用。

3）吸取稀釋血液，在離分層液上方1cm處，沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液重疊于分層液上，并與分離液形成明顯界面。

4）室溫，離心2000rpm，20min。此時離心管中形成5層：最上面是血漿，血漿層和淋巴細胞分離液之間是淋巴細胞層呈白膜狀。

5）小心吸取中間呈白膜狀的淋巴細胞層，盡量全部吸出。加5倍以上體積的PBS洗2次，每次離心1500rpm，10min。

6）去上清液，加入1640培養基1mL混勻，取少量進行細胞計數。

7）用臺盼藍染液檢查所分離的細胞活性：活性應在95％以上。

8）接種后培養，條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。3d后，每48h添加等體積的新鮮培養基。

淋巴細胞

2、乳鼠心肌細胞的原代培養

原理：

乳鼠心肌細胞屬于原代生長細胞。心肌組織中心肌細胞約占50%，非心肌細胞占50%，用酶消化法將心肌組織碎塊經純化分離成單個心肌細胞，用培養基制成心肌細胞懸液，內心肌細胞可達95%，在體外適宜條件下，使心肌細胞生長繁殖，并保留其一定的結構和功能特性。在乳鼠心肌細胞培養實驗中能直接觀察到培養心肌細胞生命活動的動態過程，還可利用電鏡手段、同位素標記、放免法和免疫組化法來研究細胞形態結構及細胞內化學物質的分布。

步驟：

1）新生乳鼠剪開胸，取心尖部位。

2）剔除周圍結締組織，將心臟置于無菌平皿中，將心臟盡量剪碎，平皿內加入適量0.125%的胰酶，在37℃培養箱中，采用分次消化，每次消化5min，一共消化8-10次。
3）每次消化后取上清液，中和胰酶的消化，防止消化過度。用200目過濾篩過濾混合液。離心后收集沉淀，用PBS再次重復離心3次。用細胞培養基將細胞沉淀重懸，接種于細胞培養瓶中培養。

4）培養90min左右，將未貼壁的細胞懸液吸出。此時已經貼壁的是心肌成纖維細胞。

5）將未貼壁的細胞懸液放入新的培養瓶中繼續培養，并每日觀察心肌細胞的生長。

心肌細胞48h

3、神經元細胞原代培養

步驟：

1）出生 2 d SD大鼠經戊巴比妥鈉麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預冷的D-Hanks平衡鹽液中。

2）在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱內消化20min，中間搖晃一次。

3）用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的培養液（DMEM＋10％FBS）的離心管內終止消化液作用5min。

4）用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的DMEM＋10％FBS的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數次，靜置后取上清吸到另一支離心管內。重復上述步驟2～3次。

5）將所收集的上清經200目篩網過濾。

6）過濾后的細胞懸液于800r/min離心5min，棄上清，管內加入新鮮培養液（DMEM＋20％FBS）并吹打成單細胞懸液。

7）細胞計數，調整細胞密度按1.5×105/cm2種入6孔板內，放入CO2孵箱中培養。培養48h后換液并加入Ara-C使其終濃度為1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量換液。以后每隔3天半量換液一次。

皮層神經元

4、小鼠血管平滑肌細胞（組織貼塊法）

試驗方法：組織貼塊法

步驟：

1)頸椎脫臼處死小鼠，開胸、腹腔，暴露心臟剪取胸主動脈
2)用鑷子輕輕剝離血管外結締組織
3)用眼科剪沿縱軸剪開血管條，無菌鑷輕輕刮除內膜
4)用鑷子鈍性加壓刮中膜,待出現裂口后夾住中膜將其取出
5)將取下的中膜加入含 20%FBS 的 DMEM 培養液，用眼科剪剪碎成血管條；
6)用無菌滴管將組織塊吸入細胞培養瓶，均勻鋪于瓶壁，間距約 0.2～0.5cm；
7)將培養瓶直立放置于培養箱；1h 后輕輕放平
8) 每 3d 換液 1 次； 3～8代用于后續實驗

血管平滑肌細胞

五、中心可提供的原代培養種類