Cisbio 的 Tag-lite HTRF 平臺能 夠 有效 地 用 HTRF 熒 光
團標記目標位點上感興趣的蛋白。細胞表面受體可以插
入 SNAP-tag 質粒中，然后用這種結構轉染細胞并表達
標記的受體。通過添加 snap -lumi4-Tb 底物，用鋱 (Tb)
穴狀化合物標記受體。為了進行結合試驗，受體的配體
用 HTRF 受體熒光團標記，例如 d2。當 d2 配體與鋱標
記的受體結合時，可以使用具備 HTRF 功能的微孔板讀
板機檢測受體到配體的時間分辨熒光共振能量轉移 (TRFRET) ( 圖 1)。
Cisbio 提供了多種標簽和興趣蛋白標記編碼的質粒，以
及已經用這些結構物轉染的冷凍細胞。該結構體能夠表
達標記蛋白，如受體，可以用鋱標記，同時其受體配體
( 激動劑或拮抗劑 ) 用受體熒光團標記。Tag-lite 平臺適
用于廣泛的應用，如受體二聚化、配體結合分析和第二信
使評估。結合動力學可以研究藥物 - 蛋白質復合物的結
合和解離速率，是優化候選藥物體內療效的必要步驟 1。
優勢
? 提供可靠的，免洗的飽和結合實驗
? Cisbio HTRF 平臺提供多種配置實驗和試劑的選項
? 已有經過認證的 HTRF 儀器，確保儀器性能
APPLICATION NOTE
利用基于 HTRF 的 Tag-lite 技術檢測胰高血糖
素 GLP-1 受體的 Kd 值
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胰高血糖素樣肽 -1 受體 (GLP1R) 在胰腺細胞中表達，其
激活刺激腺苷酸環化酶途徑，導致胰島素合成和釋放增
加。因此，GLP1R 被認為是治療糖尿病的一個潛在靶點 2。
GLP1R 也在大腦中表達，它參與控制食欲，并在記憶和
學習機制中具有潛在的重要作用。
在 這 里， 我 們 展 示 了 如 何 使 用 SpectraMax?i3x 和
SpectraMax?iD5 多功能微孔 板讀板機使 用 HTRF 進 行
可靠的、免洗飽和結合分析。使用 Tag-lite 技術在 HTRF
認證的 SpectraMax i3x 和 iD5 讀板機上評估 GLP1R 配
體的結合。
飽和結合實驗
配體結合實驗是評估特定配體與受體親和力的重要手段，
也是理解受體和配體相互作用機制的關鍵。結合研究因
此成為藥物發現過程的一部分，有助于設計出高選擇性
和特異性結合靶標藥物。結合活性決定了單個生物分子
之間的結合作用，如受體及其配體 ( 如激動劑 )。它通常
用飽和分析來檢測，用平衡解離常數 (Kd) 來表示。Kd
用于評估配體與其靶標之間的相互作用強度并對其作用
強弱程度進行排序。Kd 值越小，配體與靶標的結合親和
力越大。在競爭或抑制研究中，選擇合適的配體濃度是
準確測定 IC50 和抑制常數 (Ki) 的必要條件。一般來說，
濃度達到或略低于 Kd 值是可以接受的。使用高于 Kd 值
的配體濃度會使藥物看起來不如它們在體內的效力。
飽和結合試驗檢測總結合和非特異性結合濃度增加的配
體 ( 圖 2 )。熒光配體滴定到含有固定數量標記細胞的溶
液中，孵育至平衡。當熒光配體與受體結合時，TR-FRET
發生，并通過 HTRF 認證的微孔板讀板機進行檢測。得
到的 HTRF 比率代表總結合。非特異性結合方式作為陰
性對照，其使用未標記的配體進行檢測，說明已標記的
配體與受體、非受體分子或微板的非特異性結合 2。
檢測時，將熒光標記的配體滴定到含有固定數量標記細
胞和 100 倍摩爾濃度的未標記配體的溶液中。標記的和
未標記的配體競爭與標記的 GPCR 結合。由于非特異性
配體過多，它會與受體結合，所以不會發生 TR-FRET。從
這種滴定法得到的 HTRF 比率代表非特異性結合。通過
從每個熒光標記配體濃度的總結合減去非特異性結合來
計算特異性結合。
圖 1 Tag-lite 細胞表面結合實驗示例。GPCR 興趣基因序列插入到 SNAP-tag 質粒中，然后細胞轉染并表達該受體，GPCR 通過添加
snap -lumi4-Tb 底物共價標記一個穴狀化合物供體。最后結合實驗使用標記配體實現。
2 4
Tag-light
SNAP-tag
plasmid
GPCR-expressing
Tag-light cell
Pre-labeled
Tag-light cell
1 3 5
Tag-light
CGCR
plasmid
Transfection
GPCR labeling with
SNAP-Lumi4-TB substrate
Binding
assay
Labeled-ligand
displacement
with competing
compound
N N H
NH
N 2
N
O
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材料：
? Tag-lite GLP1R 表達，Tb 標記的冷凍細胞 (Cisbio cat.
#C1TT1GLP1)
? Tag-lite 緩沖液 (Cisbio cat. #LABMED)
? GLP1 受體紅色激動劑 (Cisbio cat. #L0030red)
? 毒晰外泌肽 4
(Exendin 4，Sigma-Aldrich cat.# 1269105)
? 白色，低體積 384 孔微孔板 (Greiner cat. #784075)
? 帶 有 HTRF 檢 測 卡 盒 (Molecular Devices cat. #0200-
7011) 的 SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機 (Molecular Devices cat. #i3x)
? 帶 有 HTRF 檢 測 系 統 (Molecular Devices cat. #6590-
0144, 包含增強型 TRF 模塊及 HTRF 濾光片 )
方法
細胞
根據產品說明準備細胞，冷凍的細胞在 37℃ 解凍，轉移
到含有 5 ml 1x Tag-lite 緩沖液 (TLB) 的試管中。4℃，
1200g，離心 5 min。吸出上清液，重懸于 2.7 ml 的 1x
TLB 中。
熒光標記配體
GLP1 受體紅色激動劑是一種用紅色熒光 HTRF 探針標記
的 Exendin 4 衍生物。將原漿濃度稀釋于 1X TLB 中制備
400 nM 濃度的紅色激動劑 ( 原漿濃度見試劑盒說明書 )。
10 個額外的 1:2 稀釋，然后用 1X TLB 得到最終濃度從
100 nM 到 0.097 nM。
非標記配體
稀 釋 原 溶 液 到 1 x TLB ( 見 產品說 明 ) 制 備 40μM 終濃
度無標記 Exendin 4 配體。這相當于最大標記配體濃度
400 nM 的 100 倍摩爾。
Total binding measurement
Non-specific binding measurement
圖 2 Tag-lite 飽和結合實驗?？偨Y和檢測通過熒光配體與受體的結合出現的 TR-FRET 測定。非特異性結合檢測是通過過量的非標記
的配體與熒光標記的配體競爭結合標記的 GPCR，未標記的配體結合至受體上 TR-FRET 不會發生。
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實驗板設置
按照 Cisbio 配體結合說明書將試劑分配到板內 ( 圖 3 )。
384 孔白板孔內注入 10 μL GLP1 受體細胞，5 μL TLB 添
加至總結和孔內，5 μL 未標記配體添加至非特異性結合
圖 3 384 孔低體積微孔板實驗設置。實驗板在室溫孵育 2 h 后，在 SpectraMax i3x 和 iD5 讀板機上檢測 TR-FRET ( 見表 1 的儀器設
置 )
表 1 i3x 和 iD5 的儀器設置
4
| lls μL |
| Total binding ? μL Non-specific binding Unlabeled ligand ? μL |
ligand
(titration)
? μL
Read on an HTRF
compatible reader
1 3
| Incubate ?h at RT |
1X
SpectraMax i3x reader SpectraMax iD5 reader
Additional components required HTRF Detection Cartridge: P/N 0200-7011 HTRF Detection System: P/N 6590-0144
Excitation 340 nm / 80 nm 340 nm / 70 nm
Emission Donor filter: 620 nm
Acceptor filter: 665 nm
Donor filter: 616/10 nm
Acceptor filter: 665/10 nm
Number of flashes 30 30
Integration delay 30 μs 20 μs
Integration time 400 μs 200 μs
Other settings Read height is easily optimized for different volumes and plate formats
孔中。最終，5 μL GLP1 受體激動劑 exendin 4- 紅色標
記物添加到所有孔中。將實驗板在室溫孵育 2 h 并用優化
的儀器設置 ( 表 1 ) 在 SpectraMax i3x 和 iD5 讀板機上
讀取。兩個讀板機都進行高度優化以確保最佳的實驗靈
敏度和動態范圍。
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數據分析
HTRF 分析涉及 Cisbio 的**比率法，該方法基于檢測
到的兩個發射波長。616 nm 處的供體發射光被用作內
參，而 665 nm 處的受體發射光被用作測定生物反應 ( 結
合 ) 的指示劑。這種比率測量 ( 受體與供體熒光的比率 )
減少了孔間的變異，并消除了化合物干擾。在下面的步驟
4 中計算的 Delta F，將信號去除背景，對于測定之間的
比較是有用的。根據 665 nm / 616 nm 的比值計算結果，
用 Delta F 表示如下 :
1. Ratio = x 104
Emission665nm
Emission616nm
2. Mean Ratio = ∑ratios
2
3. CV = x 100
Std deviation
Mean ratio
4. Delta F = Standard or sample Ratio?Rationeg x 100
Rationeg
(Rationeg = Ratio of negative control)
數據通過 SoftMax? Pro 軟件獲取并分析，軟件內已預置
了 HTRF 的模板可以簡要的檢測和分析。
GLP-1 receptor agonist (nM)
Ratio
| Parameter Kd (nM) | Cisbio’ s predefined value 5 | SpectraMax i3x reader 0.816 | SpectraMax iD5 reader 2.347 |
的比率 ( 藍色曲線 ) 為總結合率 ( 紅色曲線 ) 減去各濃度下非特異性結合率 ( 綠色曲線 ) 的比值。
表 2 Tag-lite 結合飽和曲線的結果總結
結果
對總結合孔 和非特異性結合孔的每個標記配體濃度計
算 HTRF 比率。通過從每個熒光配體濃度下的總結合減
去非特異性結合計算特異性結合。如上文所述，對數據
進 行 分析，并 使 用 SoftMax Pro 軟 件進 行 雙 直 角雙 曲
線擬合 ( 圖 4 )，得出最佳結果，讀數設置如表 1 所示。
SpectraMax i3x 讀板機產生的飽和曲線 ( 這里沒有顯示 )
與 SpectraMax iD5 讀板機類似。在特定飽和曲線中雙直
角雙曲線擬合中擬合參數 B 為 Kd。Cisbio 建立了一個 5
nM 或更低的 Kd 值，以確認酶標儀能夠成功地測量帶有
紅色受體的 Tag-lite 分析。SpectraMax i3x 讀板機的 kd
值為 0.816 nM, SpectraMax iD5 讀板機的 kd 值為 2.347
nM ( 表 2 )，證實了這兩種儀器檢測這些 Tag-lite 實驗的
能力。