新型雙壓線性離子阱質譜儀給蛋白質組學帶來革命性變化

Tonya Pekar Second, Justin Blethrow, Jae C. Schwartz, Vlad Zabrouskov, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA

關鍵詞：

LTQ Velos? 線性離子阱，蛋白質學，蛋白鑒定，肽測序、靈敏度、蛋白質組發現者

引言：

對于一個蛋白質組全面的了解是研究動態蛋白質組的基礎。蛋白質的鑒定是需要有效、穩定可靠的方法。串聯質譜尤其是線性離子阱和基于阱的雜交質譜儀日益成為肽段和蛋白質鑒定的首選。選擇此類儀器的主要原因在于該類儀器具有良好的穩定性、重現性、易用性以及良好的一級和二級譜圖質量。

在一個蛋白質組體系里，經常會存在一些低豐度不易被質譜儀鑒定到的蛋白，其中某些蛋白還會存在一些動態修飾，就更難被儀器檢測到。因此，需要發展更先進靈敏度更高的一切來應對復雜蛋白質組蛋白鑒定的需求。

本篇應用論文主要介紹了用新型雙壓線性離子阱質譜儀分析復雜、Caenorbabditis elgans(C.elegans)的肽段混合物。比較了新型雙壓線性離子阱質譜儀與線性離子阱和廣泛應用的四級桿-飛行時間質譜儀的性能。

儀器創新

在本篇文章主要測試Thermo Scientific 的LTQ Velos離子阱質譜儀。它包括了一個新型雙壓線性離子阱和高壓環形離子導入裝置（S-Lens），如圖1所示。

S-lens的射頻顯著提高了離子注入到質譜儀中，這降低了在線性離子阱中離子累積所需要的時間。

雙壓阱的第一個池的壓力比以前線性離子阱的壓力要高，大約在5×10-3Torr，這能夠顯著提高目標離子的捕獲效率、分離效率和碎裂效率。提高的分離效率顯著降低了前體離子所需要的時間，所需時間是從前的四分之一。LTQ Velos離子阱對于在有高豐度干擾離子背景下低豐度前體離子具有較好的選擇性，提高了二級質譜分析的動態范圍。高壓也縮短了碰撞誘導解離所需的時間的67%，同時保持了同樣的碎裂效率。第二個池保持較低的壓力，大約在4×10-4Torr，可以以較高的分辨率進行快速質量分析。

高捕獲效率

高裂解效率

高分離效率

5×10-3? 氦氣

高分辨率、掃描速度

3.5×10-4? 氦氣

圖一 LTQ Velos 質譜儀，高壓環形離子導入裝置（S-Lens）和新型雙壓線性離子阱（不同壓力控制）

與新型雙壓線性離子阱協力合作，在典型的數據依賴模式的串聯質譜實驗中，在阱里一種新型控制離子累積的方法能顯著提高實際的掃描速率。這個功能叫做“預測AGC”，去除了每一次串聯質譜掃描所做的預掃，基于離子流出和前一次一級質譜全掃描的母離子的相對強度，預測了離子累積所需要的時間。

實驗

樣品制備

C.elgans勻漿液的可溶性部分用pH7.8的碳酸氫銨稀釋，加入0.1%的RapiGest表面活性劑，解釋用二硫蘇糖醇在100℃還原二硫鍵，并用碘乙酰胺對半胱氨酸烷基化。樣品解釋用對K/R特異性酶酶切4個小時。酶解物質酸化后存放至-80℃。在進入反相高效液相色譜-串聯質譜前用0.1%的甲酸稀釋。

液相色譜-串聯質譜分析

為了比較和評估性能，在Thermo Scientific的LTQ XL線性離子阱質譜儀和安捷倫6520四級桿-飛行時間質譜儀一級LTQ Velos雙壓線性離子阱質譜儀對C.elegans的蛋白酶解物進行了分析，肽段混合物是在反相色譜進行分離的。詳細的色譜條件請參照表1。同時對減少進樣量進行了考察。

在所有實驗中，均采用數據依賴的串聯質譜采集方法。在每一臺儀器上至少運行3次樣品。

對于線性離子阱的數據依賴模式檢測方法，該方法主要分析十個最強的離子，根據色譜峰的峰寬，優化排除條件，色譜峰的峰寬主要是根據反相梯度長度變化。由于在LTQ Velos質譜儀離子源有較好的離子傳輸，因此一級質譜全掃描需要較低的最大注射時間。在進行二級質譜掃描的時候，可用同樣的最大注射時間，這樣可以捕獲更多的例子，進而鑒定得到低豐度的肽段（前體離子豐度較低，AGC的注射時間達到最大）。在LTQ Velos前體離子的選擇上采用數據依賴的模式，對一級質譜信號設置更高的閾值。離子轉移管的溫度為250℃，比LTQ XL更高，目的是補償短的毛細管長度。碰撞誘導解離的時間從30ms降至10ms，充分利用更高的壓力池，提高碎裂效率。LTQ Velos雙壓離子阱對于正常掃描模式同時提供了碎裂效率和掃描速率，而且阻止了單電荷的前體離子的傳輸。在數據采集模式充分利用了這個特點，詳細的采集參數如表2所示。

6520四級桿飛行時間質譜儀（Q-TOF）的采集參數如表3所示。采用了3Hz和6Hz的掃描速率，以最大化實現對肽段進行鑒定，實際有效的掃描速率為2.5Hz或5.1Hz。參數設置參考了安捷倫的技術支持，同時也與推薦文獻報道相類似。

數據庫搜索

通過用Thermo Scientific蛋白質組學發現1.0（Proteome Discovery)軟件和英國倫敦Matrix Sciences公司的Mascot2.1搜索引擎對數據進行檢索，比較離子阱和四級桿-飛行時間質譜儀所采集的數據。用于數據庫搜索的條件如表4所示。在Mascot中選中反相庫檢索選項，對所有的數據進行過濾，保證1%或更低的的假陽性率。用安捷倫的軟件Masshunter將6520的四級桿-飛行時間質譜儀所采集的數據轉換為mzdata格式，然后提交到蛋白質組學發現（Proteome Discovery)軟件。Proteome Discovery軟件會自動計算期望得分（或肽得分，如果選中的話）來過濾數據，達到滿足特定的假陽性率，然后將該過濾方法應用到數據集中。

因此，選擇高置信度的肽段過濾條件來使最終檢測到的蛋白滿足1%或更低的的假陽性率。將數據庫檢索得到的特異性肽段的數量和蛋白數進行比較。

表1 肽段一維反相色譜分離條件

表2： LTQ Velos and LTQ XL 質譜