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? ? ? ?干細胞能夠分化成為機體內任何類型的細胞，既是研究人體早期發育的理想工具，也是細胞治療的寶貴資源，在醫學領域有非常廣泛的應用。干細胞及其分化細胞的異質性是干細胞的固有特性，如果我們使用一群細胞進行測序就會掩蓋這種異質性。而單細胞測序可以幫助我們挖掘這種異質性，尋找細胞群體的變化及發生機制。
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圖1 干細胞發育以及分化研究
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從2016年十三五計劃開始后，在生物科研領域，干細胞的研究就作為一個重點課題受到科技部的特別支持，并作為首批進入國家重點研發計劃的專項。2016年和2017年科技部發布的“干細胞及轉化研究”專項，每次支持項目40個左右，單個項目從500萬~3000萬不等，總經費支持達到數十億，主要聚焦在干細胞及轉化研究的重大基礎科學問題和瓶頸性關鍵技術，力爭取干細胞及轉化研究得科學理論和核心技術的原創突破，推動干細胞研究成果向臨床應用轉化，整體提升我國干細胞及轉化應用研究水平。
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總結近兩年的重點專項課題，干細胞及轉化的研究主要集中在以下幾個方向：①細胞重編程構建多能干細胞；②組織干細胞的獲取及功能、調控；③干細胞定向分化及細胞轉分化；④干細胞移植后體內功能建立與調控；⑤基于干細胞的組織和器官功能再造；⑥干細胞資源庫；⑦利用動物模型的干細胞臨床前評估；⑧干細胞臨床研究。
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ChromiumTM Single Cell 3' Solution作為一個高通量的單細胞測序技術，全面剖析干細胞的異質性，幫助鑒定不同表型的細胞，在干細胞領域有非常廣泛的應用。目前該技術在干細胞領域的研究一共發表了多篇高水平的文章，聚焦的方向包含了多能干細胞、器官干細胞（腸道、淚腺）、間充質干細胞的分化干細胞重編程過程以及自我更新機制等。小編做了匯總，供各位科研達人參考。
表1 ChromiumTM Single Cell 3’ Solution在干細胞領域發表文章匯總
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在干細胞領域發表的文章影響因子都很高，那么這些如此有影響力的文章都在研究什么？如何設計的課題呢？小編詳細解讀了2篇用ChromiumTM Single Cell 3’ Solution發表的研究干細胞的文章，繼續給科研達人們參考。
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Distinct Mesenchymal Lineages and Niches Promote EpithelialSelf-Renewaland Myofibrogenesisinthe Lung
期刊：《Cell》發表時間：2017.9 影響因子：28.71發表單位：美國賓夕法尼亞州費城兒童醫院兒科心臟病科，賓夕法尼亞大學
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? 在成體肺組織中，上皮祖細胞從周圍的間質細胞中獲得旁分泌信號，這些信號可以調節上皮祖細胞進行增殖和分化。哺乳動物的肺組織包含大量的特定的上皮細胞，其被包圍在定義不明的異質間充質中。肺間質隔室包括氣道平滑肌（ASM），血管平滑肌（VSM），內皮細胞和界限不清的間質細胞。為了鑒定參與并提供信號以促進肺泡自我更新和再生的細胞譜系，并表征特征基因，我們使用10X單細胞轉錄組測序技術檢測發現整個肺間質分選為五類基于信號轉導途徑讀出的不同細胞譜系。 ? ? 研究人員使用單細胞轉錄組測序和信號譜系記錄產生空間和轉錄肺間質圖。發現每一個間充質譜系具有明顯的空間位置和轉錄導致獨特的利基（生態位）監管職能。間質性肺泡利基細胞Wnt信號響應，表達血小板衍生生長因子受體，對于肺泡上皮細胞生長和自愈是至關重要的。 ? 2.1 流式分選5,572個小鼠肺間質細胞使用ChromiumTM Single Cell 3’ Solution進行單細胞轉錄組測序：獲得每個細胞68k Reads數，中值基因1,017，每個細胞的平均UMI計數為2,040； ? 2.2 Axin2CreERT2：tdT和PdgfrɑCreERT2用于譜系追蹤。 ? ? 3.1 信號通路報告系統可以識別和鑒定不同的成年肺間質譜系； 我們使用最近描述由我們實驗室合成的Axin2CreERT2連同Wnt2CreERT2和PdgfraEGFP這些示蹤信號，鑒定Wnt或Pdgfr信號活動和表達的間充質細胞的相對位置和分布來解析成年鼠肺間充質隔室的復雜性。Wnt-反應的Axin2+細胞可以在整個成年鼠肺間質、肺泡區和周圍的導管氣道和血管中發現（圖1A-1D和圖2A-2D）。肺泡中許多Axin2-衍生細胞表達Pdgfrɑ，而Axin2+伴隨氣道的譜系跟蹤細胞主要表達Pdgfrβ（圖1E-1H）。 ? 圖2 信號追蹤鑒定成年小鼠肺中不同的間充質細胞和間質細胞的AXIN2表征 ? 使用Wnt2CreERT2與R26REYFP示蹤基因雜交，我們證明Wnt2+細胞僅分布于肺的肺泡區域。此外，使用免疫染色Wnt2CreERT2：R26RtdT：Pdgfrɑ小鼠，PdgfrɑEGFP示蹤數據表明，肺泡間充質細胞是區域分布的，可以根據Axin2，Wnt2和Pdgfrɑ的表達分為幾種不同的類型。總體而言，在肺泡區域發現Axin2+/Pdgfrɑ+細胞和Wnt2+/Pdgfrɑ+細胞，而Axin2+/Pdgfrɑ細胞主要存在于周圍的氣道或血管中，表明這些不同譜系中的每一個在肺中具有獨特的空間位置（圖3）。 ? 圖3 免疫組織化學染色追蹤特征基因在不同細胞的表達及間充質細胞種群的分布圖 ? 3.2 譜系特異性和單細胞轉錄組測序分析揭示了成熟肺中獨特的間充質譜系。 為了進一步評估上述各種間充質細胞類型，我們進行了群體RNA測序分析和單細胞RNA測序分析。為了獲得上述五種不同細胞群的深度測序，基于存在或不存在Axin2，Pdgfrɑ和Wnt2表達（圖4A和圖5E、F、G），使用熒光激活細胞分選來分離這些細胞。 ? 圖4 肺間質細胞具有不同的轉錄組 ? ? 圖5 為每個肺制備單細胞懸液，對于肺間質的FACS分離 ? 熒光激活細胞分選能夠分離大于90％的肺中的活Epcam-/CD31-/CD45-細胞群體，構成絕大多數的肺間充質隔室（圖6H、I）。 ? 圖6 Axin2-tdTomato標記了成年鼠肺的所有細胞的約36.6％ ? 群體RNA測序數據的主成分分析（PCA）顯示，所有五個群體都顯示出顯著不同的轉錄組（圖7B）。 ? 圖7 來自五個間充質群體的群體RNA測序的三維主成分分析（PCA）; n = 2只小鼠 ? 已知的間質標志物，包括群體RNA測序數據中的信號傳導和結構基因的分析顯示，“其他”和Axin2+細胞表現出具有豐富的基因表達的平滑肌，肌成纖維細胞或周圍細胞樣細胞的特征，例如Acta2，Tagln和Des（圖8A、D）。Pdgfrɑ+，Axin2-Pɑ+和Wnt2+細胞表現出與在肺泡中發現的產生基質的成纖維細胞相關的基因的富集表達，如Elastin(Eln),Pdgfrɑ(Pdgfrɑ)和Collagen(Col1a1)（圖8）。 ? 圖8 所選譜系富集基因的熱圖。五個不同細胞群體中每一個的特定基因的簡要列表顯示在右側D ? 在間質中表達的肌成纖維細胞標記，富含Axin2+細胞，用于指示肌成纖維細胞譜系的基因，包括Acta2和Aoc3。分析顯示，通過功能性報告讀數識別的不同間充質細胞類型代表不同的簇，來源于簇4(C4)表示的Axin2+細胞，簇2（C2）表示的Axin2-Pɑ+細胞，Wnt2+由簇1（C1）表示的細胞（圖9）。 ? 圖9 來自譜系和單細胞RNA測序的間質標記表達 ? 使整個肺間充質群體進行插入型單細胞RNA測序分析（圖4A）。評估來自5,572個肺間質細胞的單細胞RNA測序數據，t分布隨機相鄰嵌入(t-SNE)的聚類分為五個不同的組，每組由超過90個單元組成（圖10）。一些候選間質標志物的表達顯示簇4和5含有大部分Pdgfrɑ+細胞，簇2和3包含大多數Acta2-，Tagln-和Des-表達細胞（圖10）。在第2,3,4組中表達了Pdgfrβ，Col1a1在所有簇中均被廣泛表達（圖10C）。 ? 圖10 使用K-means（K = 10）的5,572個細胞的單細胞RNA-seq應用于二維tSNE圖以鑒定不同的間充質細胞群，每個簇中的最高度表達的基因分析表明，集群5代表上皮細胞沒有使用流式細胞儀分離除去 ? 圖11 從1-5列中的頂級基因產生的熱圖，右側概述，log2倍變化大于2，p值小于0.05 ? 3.3 用空間距離映射算法對肺泡壁龕中上皮間充質相互作用的研究。 為了確定上述定義的間充質譜系有助于形成具有AT2細胞群體的肺泡利基，我們開發了使用AT2細胞作為錨點的空間距離映射算法（圖12A），為我們發現的每個間充質譜系定義一個獨特的空間地址。SDM基于使用共聚焦顯微鏡的三維渲染以使用DAPI染色測量核-核的距離來鑒定所述細胞類型與表達Sftpc的AT2細胞的相對位置（圖12B）。鑒于它們優先靠近AT2細胞，這些數據表明Axin2-Pɑ+間充質譜系是可能優先與AT2細胞通信的肺泡利基的關鍵組分（圖12J） ? 圖12 距離定位肺中的肺泡利基 ? ? 本研究通過群體單細胞轉錄組測序構建了肺間質的空間轉錄組圖譜。間充質肺泡壁龕細胞主要是Wnt應答，表達Pdgfra，并且是肺泡上皮細胞生長和自我更新的關鍵。而Axin2+的肌纖維祖細胞在損傷后首先分化成具有病理損害的肌纖維細胞。這些研究定義了肺間質的細胞種類和分子框架，并展示了在組織損傷后自我更新對抗病理反應的重要的發育通路。為肺部損傷治療提供了重要的參考。 ? 群體單細胞轉錄組測序解析Lgr5+腸道干細胞自我更新過程中Wnt和R-spondin（蛋白配體）的不等效性 ? Non-equivalence of Wnt and R-spondin ligands during Lgr5+intestinal stem-cell self-renewal 期刊：《Nature》，2017.03 影響因子 ：38.138 發表單位：美國斯坦福大學醫學院 ? ? 典型的Wnt信號通路和β-連環蛋白信號通路控制著不同的發育、穩態和病理過程。Wnt配體與受體LRP5、LRP6等，使β-連環蛋白的核轉位和依賴TCF/LEF的基因轉錄。蛋白配體(RSPO1 -RSPO4)作用于不同的LGR-LGR6、RNF43和ZNRF3受體，其能增強Wnt /β-catenin信號，在體外誘導腸道器官的生長，在體內誘導Lgr5+腸干細胞分化。然而，Wnt與蛋白配體(RSPO)的互換性、功能合作和相對貢獻在體內調控Wnt信號和腸道干細胞生物學中仍然未知。本文通過群體單細胞測序探索腸道干細胞自我更新過程中Wnt信號的作用機制。 ? ? 2.1 小鼠體內注射腺病毒編碼Wnt和RSPO激動劑或抑制劑26h，然后取近端空場消化為細胞懸液； ? 2.2 使用GemCode系統流式分選了13,102個Lgr5-eGFP+細胞，單細胞捕獲效率超過50％； ? 2.3 用FACS凈化的近端空腸Lgr5-eGFP+細胞進行單細胞RNA測序。 ? ? 3.1 LGR5-,RNF43-和ZNRF3-ECD誘導的Lgr5+ISCs的消耗不是由于隱窩細胞凋亡或增殖改變的。 用RSPO受體LGR5、ZNRF3或RNF43的可溶性胞外區(ECDs)來抑制內源性RSPO信號，并將RSPO1-RSPO4結合在一起。小鼠靜脈注射腺病毒大約14-96天后，在肝臟轉導和分泌，強烈表達人LGR5、小鼠ZNRF3或小鼠RNF43的ECDs（圖13）。 ? 圖13 單次靜脈注射腺病毒至C57B1小鼠后血清表達的時間過程 ? 為了檢測pan-RSPO1-RSPO4抑制對Lgr5+胞外區的影響，小鼠靜脈內注射編碼LGR5 ECD，ZNRF3 ECD或RNF43 ECD的腺病毒或編碼IgG2ɑFc的對照腺病毒。RSPO1過表達扭轉了雙胞外區（ECDs），但沒有Ad-Dkk1表型(圖14a)。盡管定量Lgr5+ECD耗竭，單一LGR5, RNF43 或ZNRF3-ECD仍保留了隱窩增殖和Axin2-LacZ 報告信號(圖14a,d)，可歸因于剩余的傳輸擴增細胞或非蛋白配體(rspo)依賴性群體。 ? 圖14 a上部：LGR5、RNF43或ZNRF3 ECD在注射后2-14天可逆地消融小腸中eGFP標記的Lgr5細胞的表達，下部：血紅素和伊紅染色(H&E)染色 ? 圖14 d單而非雙ECD RSPO抑制在axin2-lacz Wnt報告小鼠中保存Ki67+隱窩增殖和隱窩基底Wnt信號 ?
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