我們收集整理了研究人員關于ChIP實驗的多個問題，希望對您的研究有幫助。

樣品類型

1. 問：如何選擇組織樣本的 ChIP 實驗方案？
答：對于較易處理的組織（如肝臟、腦組織等），用酶解法或者超聲法皆可。對于較難處理的組織（如肌肉等），酶解法則不一定總能得到理想結果，此時可以嘗試超聲法。
對于更特殊的組織，如植物樣品、高脂肪含量的組織，可考慮先用特殊方法進行樣本處理 [如需要特殊樣本處理的操作步驟，請聯系技術支持：tech@cst-c.com.cn]，后再利用 SimpleChIP?試劑盒嘗試實驗。

2. 問：用流式細胞術 FACS 分選后的細胞樣品做 ChIP 有什么需要注意的嗎？
答：用流式細胞術分選后的細胞樣品做 ChIP 很常見。分選必須在交聯之前完成。如果細胞樣品較多，需要分批進行，導致分選時間太長（長時間分選過程會給細胞造成壓力環境）。可以將前批次分選好的細胞先進行交聯固定，然后再進行第二輪分選，以得到足夠的樣品。等所有細胞樣品都分選-交聯固定好之后，再將所有交聯好的細胞合并做后續實驗。

流式細胞術中，抗體會結合在細胞表面。這些抗體會被細胞攜帶到染色質樣本中（SimpleChIP? 超聲法試劑盒的操作步驟中，部分細胞膜和胞質在染色質片段化超聲前已經裂解、棄去了。而酶解法試劑盒方案不會棄去細胞膜。因此超聲法試劑盒中存留的分選抗體可能相對于酶解法更少）。因此需要加入足夠量的 Protein G 微珠，以避免共沉淀步驟中與 ChIP 抗體結合的固相介質不足。

交聯固定

3. 問：是否可用其他交聯劑代替甲醛？是否可以用不同交聯劑交聯兩次？
答: 除了甲醛之外，也可以使用 EGS [Ethylene glycol bis (succinimidylsuccinate) ] 等其他在 ChIP 中使用的交聯劑。有一些文獻發表過兩次交聯的 ChIP 實驗方案：「Cells were washed twice with PBS, and a first cross-link was performed by adding PBS containing 1.5 mM final concentration of EGS. Following 15 min incubation at room temperature with agitation, formaldehyde was added directly to the PBS-EGS at 1% final concentration and cells were incubated at room temperature for 15 min before addition of glycine solution (0.125M final concentration) to arrest the cross-linking reaction. After 10 min incubation at room temperature with agitation followed by washing twice with PBS, cells were scraped in 5 ml of cold PBS and were pelleted by centrifugation at 3,000 rpm for 5 min at 4°C."

兩次交聯和長時間交聯類似，雖然能夠增強較弱結合蛋白的 ChIP 效率，但是也可能造成過度交聯。過度交聯會給樣品超聲片段化造成麻煩。如果交聯過度，可能需要更長時間的超聲以達到理想的染色質片段化。如果超聲時間過長，同樣會影響染色質的穩定性，進而影響 ChIP 效率。也有觀點建議洗掉第一輪的交聯劑可能會有所改善。

目前，單一使用甲醛做 ChIP 交聯的比例應該超過九成。如有必要，可適當增加甲醛交聯的時間，應該能與多次交聯達到類似效果。CST 目前沒有數據能說明兩次交聯效果優于一次長時間交聯。

請注意，僅在組織樣本的轉錄因子、共轉錄因子的 ChIP 實驗中才考慮嘗試增強的交聯條件。

4. 問：我們醫院用多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）儲存腫瘤組織樣本，是否會被過度交聯？
答：不會，多聚甲醛本身不是交聯劑，只有在加熱或堿性條件下，分解為甲醛后才具有交聯效果。儲存在多聚甲醛中的組織樣本，在染色質制備時，應用 37% 的含甲醇甲醛或 16% 的無甲醇甲醛。

5. 問：在 ChIP 收集細胞的過程中，可以通過胰酶（Trypsin）消化細胞嗎？如果可以的話，先固定，后消化？還是先消化，再固定？
答：不建議用胰酶消化，盡量按說明書方案操作。固定之前加胰酶處理，細胞中的信號蛋白會發生一定改變；固定后加胰酶處理，蛋白和核酸結合會受到破壞。因此不建議用胰酶處理。

若實在需要，可考慮嘗試固定之后，加入下一步的緩沖液（酶解法：Buffer A；超聲法：ChIP Sonication Cell Lysis Buffer），再輕刮細胞，進行后續實驗。

片段化：超聲

6. 問：影響超聲效果的重要注意事項有哪些？
答：首先是樣本體積，不能過大。其次是探頭位置，需要選擇合適大小的超聲探頭置于樣本液面以下接近試管底部幾毫米的位置。同時避免碰觸管壁或管底，以防泡沫產生，導致超聲不均勻或不足。最后是溫度控制，每次超聲的功率不能太大。單次超聲時間不能太長，注意保持冰水浴的低溫狀態。

7. 問：超聲操作方案中什么樣的超聲儀器最好用？
答：有三種主要的超聲儀類型：探頭式（接觸式）、封閉震蕩式 Biorupter（非接觸式）、水浴式（非接觸式）。根據諸多用戶的反饋，Biorupter 相對來說最不適合做 ChIP 超聲，因其 DNA 片段化效率低，達到理想片段化的超聲時間可能長達 12 分鐘，長時間超聲可能導致蛋白被破壞。探頭式超聲儀最便宜，而且 DNA 片段化效率高，因此我們推薦盡可能采用探頭式超聲儀來做 ChIP 的 DNA 片段化。水浴式（如 Covaris）也能使用，需要根據經驗來摸索超聲條件。

片段化：酶解

8. 問：酶解法實驗操作中，MNase 在 37 度片段化染色質的時候，孵育體系 Buffer B 中沒有加入 PIC，目標蛋白是否會被降解？
答：以 CST 的經驗來看，尚未碰到 MNase 處理過程中出現蛋白降解問題的先例。首先，MNase 處理染色質僅 20 分鐘。其次，Buffer B 中的特定成分（如 DTT 等）也能幫助保護染色質中的蛋白質。

解交聯

9. 問：ChIP 洗脫和解交聯步驟可以合并進行嗎？因為這兩步都是在 65 度孵育。
答：不建議將這兩步合并。ChIP 洗脫過程中，抗體-染色質復合物會從 Protein G 微珠上洗脫下來，這步在恒溫振蕩混勻儀（Thermomixer）中以 1,200rpm 左右轉速進行，較為劇烈。如果蛋白酶 K 在此時加入，原本共價偶聯在微珠上的 Protein G 會被蛋白酶 K 消化，進而相應的降低蛋白酶 K 對抗體-染色質復合物的消化效率。同時，Protein G 上非特異結合的 DNA 也可能被更多的洗脫在溶液中，造成可能的背景信號升高。

10. 問：ChIP 實驗解交聯步驟中，蛋白酶 K 的處理步驟耗時較長，能否用少于 2 小時？
答：解交聯步驟對后續得到 DNA 得率和純度很關鍵，為了保證反應充分完全，建議孵育時間不少于 2 小時。

抗體選擇

11. 問：IP 級別的抗體能否用于 ChIP 實驗？
答：ChIP 實驗對抗體的要求高于 IP 實驗。若使用未經過 ChIP 實驗驗證的 IP 級抗體進行 ChIP 實驗，可能帶來信號過低或背景過高的問題，而對于ChIP后的測序分析，是檢測全基因組范圍內的結合作用，因而需要更高級別的ChIP-seq抗體，選擇如下鏈接了解更多CST的ChIP-seq驗證抗體：https://www.cst-c.com.cn/browse/chromatin-ip-seq?N=4294955758+4294964832+4294956287

檢測方法：ChIP-qPCR

12. 問：如何確定目標蛋白與 DNA 的結合位點在哪里？
答：ChIP 實驗前，通過生物信息學的方法進行預測（可參考李振亞博士的文檔）。在獲得 ChIP 陽性結果后可以考慮做預測結合位點的點突變的同時做 ChIP 實驗，觀察信號是否顯著降低，以此來判斷 DNA 結合位點。

13. 問：ChIP-seq 與 ChIP-qPCR 檢測方法如何選擇？
答：ChIP-seq 關注的是基因組或者染色體組上的整體信息，而 qPCR 關注某些基因位點的特定信息。在做 ChIP-seq 之前和之后常常需要利用 q-PCR 進行測試和驗證。

檢測方法：ChIP-seq

14. 問：ChIP-seq 的 DNA 片段合適大小是多少？
答：根據 ChIP 的實驗原理，我們期望獲得大小在一個到幾個核小體的 DNA（大約 150bp-1kb）。由于目前二代測序平臺基本只會測取小于 500bp 的 DNA 片段，所以只要大多數 DNA 片段集中在幾百 bp 范圍都是適合測序分析的，不需要額外的進行片段大小篩選。

15. 問：ChIP-seq 用 20M 的深度 (75bp x 20M = 1.5 Gb) 對 Input DNA 進行 NGS 測序是否足夠？人類基因組有 3 Gb。
答： 為了充分平行對照，在測定 ChIP 后 DNA 和 Input DNA 時需要采用同樣的深度。如果用 40M 的深度去測序也是可行的。深度越深，越容易捕獲到較弱的結合作用（弱峰）。關于 ChIP-seq 細節的疑問可以參考以下文獻「ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia (Genome research, 2012)」。10M 的深度測序在哺乳動物細胞的轉錄因子 ChIP 中即可接受。

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