1.核酸測序
高通量測序技術(shù)（NextGen）
微生物的前沿研究主要依托于核酸測序速度和通量的增加。在1977-2005年間，主要的測序方法為Sanger雙脫氧鏈終止法，但是如果利用它進行單個細(xì)菌基因組測序可能需要花費多年的時間，因此隨著高通量測序技術(shù)的推出，Sanger法很快就退出了主流舞臺。
高通量測序技術(shù)使用了多個高通量測序平臺：第一種是Roche GS20 454（羅氏的454平臺，2005-2016），該平臺主要基于焦磷酸測序原理。雖然454測序是一個關(guān)鍵的技術(shù)進步，但是該平臺存在測序試劑昂貴、復(fù)雜重復(fù)序列錯誤率高以及磁珠載荷存在局限等缺陷，從而限制了其通量和獲得的序列條數(shù)。第二種是Solexa（現(xiàn)在的Illumina）Genome Analyzer (GA)，該平臺借助于邊合成邊測序、可逆阻斷和橋式PCR等技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于人、微生物等領(lǐng)域的核酸測序研究，而且個別儀器單個run可產(chǎn)生>1.8 TB的數(shù)據(jù)。Illumina目前包括GA, MiSeq 和HiSeq系列等多個測序平臺，可以進行100-300 bp 雙端測序，有望實現(xiàn)每年進行大于18000個人的基因組測序（3 Gbp，每個人1000美元）。此外，Illumina還推出了TruSeq（Moleculo）平臺，讀長可達到>8 kbp ，該平臺推進了高復(fù)雜微生物群落中微生物序列的組裝。
圖1. 不同測序技術(shù)的通量和讀長。
單分子測序技術(shù)
單分子測序技術(shù)是微生物組研究中新興的測序技術(shù)。該技術(shù)中，首屈一指的當(dāng)屬PacBio的SMRT測序技術(shù)，該技術(shù)基于依靠拴系的DNA聚合酶和零模式波導(dǎo)來引導(dǎo)光能通過小體積的液體。PacBio提供的reads長度可以達到10-25 kbp，每個cell可以提供 ~300 Mbp數(shù)據(jù)。此外，該技術(shù)還可以檢測特殊的或者修飾后的核酸堿基（不需要在合成過程中進行化學(xué)修飾），這是因為遇到特殊的堿基之后聚合酶會發(fā)生wobble。
另一種單分子測序平臺為Oxford Nanopore，該平臺主要依賴于被測核酸序列通過蛋白納米孔時電導(dǎo)率的變化，通過監(jiān)測電導(dǎo)率的變化進行測序，該平臺同樣可以檢測被修飾的堿基，平均讀長~1-2 kbp，有研究表明最長讀長甚至達到>90 kbp，該平臺最大的優(yōu)點是可以利用無線技術(shù)傳輸數(shù)據(jù)并進行實時分析。
這些新興技術(shù)的主要挑戰(zhàn)是獲得數(shù)百條長度為kbp甚至Mbp的高質(zhì)量和大分子量的DNA，例如，PacBio測序平臺需要微克級高分子量DNA（>40 kbp）用于文庫構(gòu)建。此外，這些技術(shù)的通量都相對比較低。但是對于序列組裝方面的應(yīng)用而言，這些單分子測序平臺為微生物群落研究提供了一定的技術(shù)支撐。
微生物群落測序
DNA測序技術(shù)在發(fā)現(xiàn)、識別、鑒定微生物潛在功能方面發(fā)揮著重要作用，目前大部分的研究主要是多樣性研究，即利用微生物基因組片段上一段擴增子序列進行細(xì)菌、真菌以及古菌的測序分析。此外，也有部分宏基因組方面的研究，利用該研究可以發(fā)現(xiàn)微生物群落中與某一特殊物種相關(guān)的功能基因。然而，大部分基因的功能目前還是未知的，這預(yù)示著對于環(huán)境微生物的研究依然任重而道遠。
宏轉(zhuǎn)錄組
宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)是對某環(huán)境中所有微生物的mRNA進行測序分析，從而來探索某一時間或空間中特定微生物的基因表達情況。該技術(shù)有助于對宏基因組數(shù)據(jù)進行相關(guān)驗證以及了解不同環(huán)境中微生物相對活性的變化情況。
2. 基于質(zhì)譜技術(shù)的宏蛋白組學(xué)和宏代謝組學(xué)研究
盡管測序技術(shù)很大程度上加強了人們對于微生物系統(tǒng)發(fā)育以及功能基因組成的認(rèn)識與理解，但是要想研究執(zhí)行生命功能的蛋白質(zhì)以及與其相關(guān)的代謝產(chǎn)物與環(huán)境等因素之間的關(guān)系，僅僅依靠這些數(shù)據(jù)還遠遠不夠，因此需要借助質(zhì)譜技術(shù)達到這一研究目的。在利用質(zhì)譜技術(shù)進行微生物群落樣本分析時，感興趣的生物分子會被離子化，并根據(jù)質(zhì)荷比分離開來，以達到檢測的目的。質(zhì)譜分析具有高靈敏度、高分辨率和高通量的特點。
自1984年electrospray ionization (ESI，電噴霧離子化技術(shù))產(chǎn)生以來，利用質(zhì)譜技術(shù)進行生物分子的研究日益劇增。電噴霧離子化技術(shù)的局限是需要在760 torr的氣壓下進行，但是質(zhì)譜分析的氣壓要求在10-6 and 10-11 torr之間，兩者間的氣壓差至少有9個數(shù)量級，如果離子化程序和質(zhì)譜分析程序未能完美的契合，會導(dǎo)致大量離子流失。因此，在過去的20年，質(zhì)譜研究主要聚焦在優(yōu)化ion funnels和transmission quadrupole部分的接口設(shè)計，旨在解決銜接過程中減壓問題，該部分的優(yōu)化有利于降低離子流失并提高分析的敏感性。
然而，因為質(zhì)譜結(jié)果的高動態(tài)范圍以及樣本中組成種類成千上萬，所以利用質(zhì)譜技術(shù)研究微生物群落生物分子存在一定的難點。為克服這一難點，要求質(zhì)譜技術(shù)要有高分辨率、高準(zhǔn)確性和高速度等特性。
在orbitrap（軌道阱）技術(shù)出現(xiàn)之前，Quadrupole（ 四極桿質(zhì)量分析質(zhì)譜）, ion trap（離子阱質(zhì)譜）, time-of-flight（飛行時間質(zhì)譜）和ion cyclotron resonance (ICR，離子迥旋共振分析質(zhì)譜）是主要的幾種質(zhì)譜技術(shù)。在過去的幾十年中，orbitrap技術(shù)發(fā)展出了包括 linear ion trap (low resolution) 和orbitrap（high resolution）在內(nèi)的具有高分辨率和高掃描率的技術(shù)。
圖2. 基于離子阱的質(zhì)譜技術(shù)演變。
此外，分離技術(shù)的發(fā)展，例如一維和二維的液相色譜分離技術(shù)、氣相離子遷移譜法都促進了微生物群落的研究。這些分離技術(shù)降低了樣本檢測前的復(fù)雜度，提高了檢測樣品中蛋白質(zhì)和代謝物的覆蓋率。
3.復(fù)雜環(huán)境微生物研究的局限和未來的方向
在過去幾十年中，核酸測序技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展使得研究復(fù)雜環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)成為可能。早在2000年，Banfield和其課題組成員首次結(jié)合高通量測序技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)研究了酸性廢礦水中多樣性較低的微生物群落結(jié)構(gòu)。隨后，利用高通量測序技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)或者兩種技術(shù)結(jié)合進行微生物群落的研究日漸增長。隨著技術(shù)的不斷提高，人們期望對于微生物群落表型的認(rèn)識能夠更加深入。
圖3. 微生物群落研究歷程。
目前，對于微生物群落功能的認(rèn)識與理解仍然是任重道遠。當(dāng)然，在該過程中依舊面臨著很多挑戰(zhàn)。其中最大的難題是生物信息學(xué)和計算方面瓶頸，包括非冗余基因集構(gòu)建、微生物注釋信息的完善和多組學(xué)結(jié)合的算法問題。面臨的挑戰(zhàn)還包括生物大分子的抽提；完整基因組數(shù)據(jù)的組裝；利用質(zhì)譜技術(shù)研究宏蛋白組、宏代謝組數(shù)據(jù)需要更快速、通量更高等。
其實，除了挑戰(zhàn)，微生物群落研究的前景還是很寬廣的。近來，白宮科學(xué)和技術(shù)政策辦公室（OSTP）宣布啟動新的國家微生物組計劃（National Microbiome Initiative ，NMI），該計劃旨在提高微生物研究的相關(guān)技術(shù)，推進對微生物群落的理解。人們堅信這項政策會更快的推進核酸測序技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)在微生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用，并獲得更加深入的微生物群落的相關(guān)信息。此外，人們還期望，在這項政策的鼓舞下會誕生前所未有的新技術(shù)，例如，更高分辨率的肽段（或者代謝物）離子遷移分離手段或者新的可用于分子注釋的數(shù)據(jù)庫。
這些技術(shù)和計算的改進為破譯微生物在其所處環(huán)境中扮演的角色以及其對其他生物，甚至對生態(tài)系統(tǒng)的健康與可持續(xù)性的影響在未來十年將發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
如此深入了解微生物群落的表型將有助于更好地理解一些過程，例如氣候變化、疾病對微生物功能的影響，使得我們能夠更好的預(yù)知這些變化可能造成的影響，促進生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展和人類健康的策略。