人 (Human) III型膠原(Collagen Type III)ELISA 檢測試劑盒
用 途：
人III型膠原(Collagen Type III) ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、緩沖液中細胞上清液及各種體液中的III型膠原(Collagen Type III) 。本試劑盒可以檢測天然和重組的III型膠原(Collagen Type III) 。本試劑盒專用于科研、而非用于臨床診斷。
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試驗原理：
III型膠原(Collagen Type III) 試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知III型膠原(Collagen Type III) 濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將III型膠原(Collagen Type III) 和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中III型膠原(Collagen Type III) 的濃度呈比例關系。
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試劑盒內容及其配制
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試劑盒成份（2-8℃保存） |
96孔配置 |
48孔配置 |
配制 |
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96/48T酶標板 |
1塊板（96T） |
半塊板（48T） |
即用型 |
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塑料膜板蓋 |
1塊 |
半塊 |
即用型 |
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標準品：240ng/ml |
1瓶（0.6ml） |
1瓶（0.3ml） |
按說明書進行稀稀 |
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空白對照 |
1瓶（1.0ml） |
1瓶（0.5ml） |
即用型 |
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標準品稀釋緩沖液 |
1瓶（5ml） |
1瓶（2.5ml） |
即用型 |
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生物素標記的抗III型膠原(Collagen Type III)抗體 |
1瓶（6ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
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親和鏈酶素-HRP |
1瓶（10ml） |
1瓶（5.0ml） |
即用型 |
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洗滌緩沖液 |
1瓶（60ml） |
1瓶（30ml） |
按說明書進行稀釋 |
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底物A |
1瓶（6.0ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
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底物B |
1瓶（6.0ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
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終止液 |
1瓶（6.0ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
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自備材料
1．? 蒸餾水。
2．? 加樣器：5ul、10 ul、50 ul、100 ul、200、500 u、1000lul。
3．? 振蕩器及磁力攪拌器等。
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安全性
1．? 此試劑盒的人血制品中的HbsAg、和抗HIV為陰性，但沒有實驗室可完全保證此血制品不會傳染肝炎、AIDS或其它傳染病，依據當地的安全條例處理本試劑盒里的成份及血清和血漿等樣品。
2．? 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
3．? 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
4．? 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
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操作注意事項
1．? 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
2．? 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
3．? 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4．? 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5．? 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6．? 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7．? 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8．? 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9．? 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
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樣品收集、處理及保存方法
1、? 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、? 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、? 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、? 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
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試劑的準備
1．? 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
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240 ng/ml |
（6號標準品） |
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
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120 ng/ml |
（5號標準品） |
100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
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60 ng/ml |
（4號標準品） |
100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
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30 ng/ml |
（3號標準品） |
100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
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15 ng/ml |
（2號標準品） |
100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
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7.5 ng/ml |
（1號標準品） |
100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
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0 ng/ml |
（空白對照） |
原始濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
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2．? 洗滌緩沖液（20×）的稀釋：蒸餾水20倍稀釋。
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操作步驟
1．? 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2．? 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3．? 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4．? 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作四次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5．? 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．? 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作四次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7．? 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育15分鐘。避免光照。
8．? 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9．? 在450nm波長處測定各孔的OD值。
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建議使用的實驗方案
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標準品濃度（ng/ml） |
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A |
240 |
240 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
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B |
120 |
120 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
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C |
60 |
60 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
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D |
30 |
30 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
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E |
15 |
15 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
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F |
7.5 |
7.5 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
G |
0 |
0 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
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H |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
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結果分析
以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的III型膠原(Collagen Type III) 標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的III型膠原(Collagen Type III) 含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
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局限
6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到精確的結果。
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試劑盒性能
1．? 靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2．? 特異性：不與人其它細胞因子反應。
3．? 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。