5'DNA Adenylation Kit，即5’DNA腺苷酰化試劑盒，是一種非常便捷和高效的通過酶學(xué)方法將單鏈DNA (ssDNA) 5’端腺苷酰化修飾的試劑盒。
本試劑盒制備產(chǎn)生的5’端腺苷酰化修飾的單鏈DNA，常用于miRNA等3’端為羥基的RNA或3’端為羥基的單鏈DNA在克隆、高通量測序建庫或PCR檢測等時(shí)，在3’端添加的接頭。
本試劑盒進(jìn)行腺苷酰化修飾反應(yīng)時(shí)，需要腺苷酰化酶(Adenylase)、ATP和待腺苷酰化修飾的5’端磷酸化的單鏈DNA。
本試劑盒腺苷酰化修飾效率高，通常可以達(dá)到95%以上。對5’端磷酸化的單鏈DNA進(jìn)行腺苷酰化修飾反應(yīng)時(shí)，無論該單鏈DNA的3’端是否進(jìn)行了氨基化等封閉都可以得到高產(chǎn)量的腺苷酰化產(chǎn)物。通常本試劑盒能將95%以上的5’端磷酸化的DNA (pDNA)轉(zhuǎn)化成腺苷酰化DNA (AppDNA)，因此腺苷酰化的產(chǎn)物通常不需要進(jìn)行電泳切膠回收，可以直接通常乙醇沉淀進(jìn)行進(jìn)一步濃縮后用于后續(xù)的連接反應(yīng)。
本產(chǎn)品以5’端磷酸化的單鏈DNA為底物，腺苷酰化酶將ATP分解成AMP和PPi，AMP轉(zhuǎn)移到單鏈DNA的5’磷酸基團(tuán)上，形成腺苷酰化單鏈DNA，從而制備出腺苷酰化接頭(linker)。
本試劑盒催化5’端磷酸化單鏈DNA生成5’端腺苷酰化修飾單鏈DNA的效果參見圖1。
圖1. 使用5’ DNA Adenylation Kit制備5’端腺苷酰化修飾單鏈DNA的效果圖。反應(yīng)體系為20μl，單鏈DNA的終濃度為5μM，反應(yīng)條件為65oC分別孵育15、30、45、60和90min，反應(yīng)完畢后85℃孵育5min終止反應(yīng)。電泳上樣前95℃孵育5min隨后置于冰浴以充分變性，尿素(7M)變性聚丙烯酰胺凝膠(15%)進(jìn)行凝膠電泳分析。如圖所示，本試劑盒在15min內(nèi)就可以將大部分5’端磷酸化單鏈DNA (pDNA)催化生成腺苷酰化的單鏈DNA (AppDNA)，孵育60min可以確保將95%以上的底物轉(zhuǎn)化成腺苷酰化修飾的單鏈DNA。
本產(chǎn)品也可以用于5’端磷酸化的單鏈RNA的5’端腺苷酰化修飾，可根據(jù)具體應(yīng)用選擇合適的實(shí)驗(yàn)步驟，同時(shí)需要額外準(zhǔn)備R0102 RNase Inhibitor和R0021 DEPC水等。
本產(chǎn)品包含的Adenylase來源為嗜熱古細(xì)菌，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)而獲得。
優(yōu)點(diǎn)：單步反應(yīng)即可完成5’端磷酸化修飾的單鏈DNA或RNA的腺苷酰化修飾，與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比較，更加簡便；對于底物轉(zhuǎn)化效率高達(dá)95%以上，無需切膠純化僅需酒精沉淀等即可用于后續(xù)反應(yīng)；在65℃這樣一個(gè)較高的溫度反應(yīng)，可以有效避免二級(jí)結(jié)構(gòu)對于5’端腺苷酰化修飾反應(yīng)的干擾；適用于pmol級(jí)別底物量的反應(yīng)體系，也可以很方便地放大至μmol級(jí)別底物量的反應(yīng)體系。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| R0716S-1 | Adenylase | 20μl |
| R0716S-2 | 10X Adenylation Reaction Buffer | 25μl |
| R0716S-3 | ATP (1mM) | 25μl |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| R0716M-1 | Adenylase | 100μl |
| R0716M-2 | 10X Adenylation Reaction Buffer | 125μl |
| R0716M-3 | ATP (1mM) | 125μl |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，至少一年有效。
注意事項(xiàng)：
底物單鏈DNA或單鏈RNA的5’端磷酸化是必須的，3’端可以進(jìn)行氨基化等封閉，也可以不封閉。
本試劑盒提供的腺苷酰化反應(yīng)體系可以按比例放大反應(yīng)體系，對腺苷酰化產(chǎn)物的得率無顯著影響。
本試劑盒提供的Adenylase的最佳反應(yīng)溫度為65℃，并且在25℃時(shí)會(huì)出現(xiàn)去腺苷酰化現(xiàn)象，因此反應(yīng)完成后推薦在85℃孵育5min以失活A(yù)denylase。如果沒有失活A(yù)denylase，后續(xù)經(jīng)歷室溫溫度條件時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腺苷酰化比率下降。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
磷酸化的ssDNA序列 5’端腺苷酰化：
1.解凍5’端腺苷酰化修飾反應(yīng)所需的各種試劑，將Adenylase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
2.參考下表在冰浴中配制如下反應(yīng)體系：
| Reagent | Volume | Final Concentration |
| Water (DNase free or DEPC-treated) | 13μl | - |
| ssDNA or ssRNA (100μM) | 1μl | 5μM |
| 10X Adenylation Reaction Buffer | 2μl | 1X |
| ATP (1mM) | 2μl | 0.1mM |
| Adenylase | 2μl | - |
| Total Volume | 20μl | - |
注意：
a.如果同時(shí)進(jìn)行多個(gè)連接反應(yīng)，可以把上表中除Nicked dsRNA Substrate之外的所有溶液和酶提前預(yù)混合，然后再分裝到各反應(yīng)管內(nèi)。
b.如果涉及RNA操作，需要嚴(yán)格按照RNA操作的規(guī)范進(jìn)行，避免RNase污染，相關(guān)試劑和耗材需要經(jīng)過DECP處理去除RNase或者確保是RNase free的。如果涉及單鏈RNA，推薦適量添加R0102 RNase Inhibitor。
3.腺苷酰化反應(yīng)：65℃孵育1h。個(gè)別情況為了使連接反應(yīng)更加充分，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間。
4.終止反應(yīng)：85℃孵育5min。
5.腺苷酰化產(chǎn)物的電泳鑒定：電泳上樣前95℃孵育5min隨后置于冰浴，以充分變性。尿素(7M)變性聚丙烯酰胺凝膠(15%)進(jìn)行凝膠電泳分析。腺苷酰化修飾后分子量會(huì)變大一點(diǎn)(參考圖1)。
6.濃縮及后續(xù)用途：可以采用常規(guī)的乙醇沉淀方法進(jìn)行濃縮，后續(xù)可以使用T4 RNA Ligase2, truncated (200U/μl)等用于和小RNA等的3’羥基的連接反應(yīng)。
常見問題：
1.腺苷酰化反應(yīng)不完全或反應(yīng)產(chǎn)物非常少。
a.用于制備腺苷酰化接頭時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)不完全的情況，建議可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間至2h甚至過夜。
b.在不改變底物量的前提下適當(dāng)增加酶量，或在不改變酶量的前提下適當(dāng)減少底物量。
c.當(dāng)?shù)孜餅閟sRNA時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)ssRNA降解的情況，建議使用RNase Free的水及耗材。
d.電泳條帶不清晰或彌散，建議用尿素(7M)變性聚丙烯酰胺 (15%)凝膠；當(dāng)?shù)孜餅閟sDNA時(shí)，建議電泳條件為180V，50-60min；當(dāng)?shù)孜餅閟sRNA時(shí)，建議電泳條件為50-60V，20-30min；若上樣前用電泳液沖洗上樣孔中的尿素，會(huì)得到更理想的電泳條帶。
e.放大體系在65℃水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)進(jìn)行1h或更長時(shí)間時(shí)，會(huì)明顯觀察到有白色沉淀出現(xiàn)，這是Adenylase沉淀所致，這時(shí)通常底物已反應(yīng)完全，所以酶的析出不會(huì)對產(chǎn)物的得率產(chǎn)生顯著影響。?