注： PE 和 APC 的完整操作步驟及標記方案在最后兩頁，如果不需要看介紹，可直接跳過

藻 紅 蛋 白 (R-PE 及 B-PE)

特 點 ：

1.從紅藻中純化

2.具有極高的發射量子產率

3.熒光團與蛋白質主鏈共價結合，不被淬滅

4.高水溶性

 R-PE    與 B-PE    的 區 別 ：

                              Wavelength (nm)                             Wavelerngn (mm)

R-PE   與 B-PE    的 對 比 ：

1.特 點 ：

1.從藍藻中純化

2.具有極高的發射量子產率

3.熒光團與蛋白質主鏈共價結合，不被淬滅

4.高水溶性

APC 和 C-PC  的區別：

APC 和 C-PC 的對比：

交 聯 APC    和 APC     的 對 比 ：

1.APC    結構： 它具有α和β亞基，具有明顯的(αβ)3 四級結構。

2.為什么要將APC 進 行 交 聯 ? 答 ：交聯是為了防止APC 在稀釋或暴露于變性鹽(如尿素或鹽酸胍) 時

發生可逆解離，從而保持其結構和功能穩定。

3. 如何進行 APC 交聯?

答：通過α和β亞基間的特異性交聯可以阻止APC 的分解。

交聯比：>1.0

注：圖中的紅色線條為沒有添加NaClO4,   藍色線條為添加了NaClO4。

如圖及表中信息所示， CL-APC  圖中添加NaClO4  及沒添加NaClO4,   吸收比沒有明顯變化。而在未交聯的APC

中， 添加NaClO4,    得到的吸收比有非常大的變化， 因為APC中加入了NaClO4  導致了它出現了解離。

2.

特 點 ：

1.存在于大多數光合作用的甲藻中

2.高水溶性

3.大斯托克斯位移

光 譜 特 性 ：

優 點 ：

1.高量子產率

2.高水溶性

3.大量結合位點

4.匹配流式細胞儀

5.大斯托克斯位移

6.制備串聯染料的良好供體

優 點 ：

1.高量子產率

2.高水溶性

3.大量結合位點

4.匹配流式細胞儀

5.大斯托克斯位移

6.制備串聯染料的良好供體

4.

注1:整個綴合過程可以在一天內完成。但是，綴合前對 PE 的純化可能需要24-48小時。除了下面列 出的材料外，您還需要濃度至少為 2 mg/ml   的抗體溶液。請您在進行PE 抗體綴合實驗之前熟悉如

何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。

注 2 : SMCC-PE   綴合物非常穩定 (在“交換緩沖液”中，在4C 下至少可以穩定幾個月)。因此， 如果您需要節省一部分時間，可以選擇同時綴合10 毫克或更多的 PE,  并將其用于幾次抗體實驗(在

幾周內)。 SMCC-PE    的長期儲存最好是作為飽和硫酸銨沉淀物。

一  .P E 的 制 備

1.將 PE 純化。綴合前的濃度通常為 5-10  mg/ml  。 注意： PE  在綴合前作為 SAS  ( 硫 酸 銨 鈉 ) 沉

淀物最穩定。如果將 PE   以 SAS   沉淀物的形式儲存，則必須在使用前進行大量純化。

2.使用3 .5毫克R-PE 修飾每毫克lgG,    包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。

3. 檢查 PE  的純度和濃度，請測量280、565 和 6 2 0 nm   處的吸光度。  (1  mg/ml      的 PE  在 565nm   處的 OD  為 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻藍蛋白；565/280 比 率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白質。

二 .P E 的 活 化

1.使用前在無水 DMSO   中制備 10  mg/ml     的 SMCC  儲備溶液。

2.每毫克 PE 加 入 1 1 μlSMCC,    并進行渦旋。將反應管用鋁箔包好，室溫下旋轉60 分鐘。

3.將純化的 PE  過凝膠過濾柱來交換緩沖液。

注意：對于失敗或效果較差的結合，增加或減少 SMCC   相對于 PE   的量，可能會有所好轉。

三 . 1gG    還 原

1.在蒸餾水中制備 1 M  DTT(15.4       mg/100       μl)  的新鮮溶液。

2.1gG  溶液濃度應為 4 mg/ml   或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進行； MES 、 磷酸鹽和 TRIS    緩沖液 (pH     范圍為 6 至8)已被驗證可以使用。如果抗體濃度低于 2  mg/ml,   則應濃縮。緩沖液交換柱上的損失應額外增加10%。

3.用 DTT  配制 20 mMlgG    溶液：每毫升 IgG   溶液加入 20μ lDTT      原液并攪拌。室溫下靜置30

分鐘，無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。

4.將還原的lgG 通過預平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級分，測定蛋白濃度，并將含

有大部分lgG 的級分匯集在一起?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。

5.此步驟后盡快進行綴合。

注意：對于結合較差或失敗的情況，降低 DTT   濃度可能會有所幫助。

四 .進 行 綴 合

1.每毫克 IgG 添 加 3.2 毫克 SMCC-PE。    用鋁箔包裹反應管并在室溫下旋轉60 分鐘。注意：這些

摩 爾 比 ( 每 IgG   約 2 個 PE)   效果很好。對于失敗或效果不佳的結合，不同的摩爾比可能會有所幫 助。

2.60 分鐘后，必須去掉 lgG   上未反應的游離巰基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO   中制備 10 mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每 毫 克 |gG  添加 34μ g(3.4μl)       。 室溫下包裹并旋轉20 分鐘。

1.

2.60 分鐘后，必須去掉 lgG   上未反應的游離巰基。

3.在 1.0 ml  干 DMSO  中制備 10  mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl)      。 室溫下包裹并旋轉20 分鐘。

2.

注1:整個綴合過程可以在 一天內完成。但是，綴合前對APC 的純化可能需要24-48小時。除了下面

列出的材料外，您還需要濃度至少為 2 mg/ml   的抗體溶液。請您在進行APC 抗體綴合實驗之前熟悉

如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。

注 2 : SMCC-APC    綴合物非常穩定(在“交換緩沖液”中，在4C 下至少可以穩定幾個月)。因此，  如果您需要節省一部分時間，可以選擇同時綴合10 毫克或更多的 APC,  并將其用于幾次抗體實驗(

在幾周內)。 SMCC-APC     的長期儲存最好是作為飽和硫酸銨沉淀物。

一  .A  PC 的 制 備

1.將 APC  純化。綴合前的濃度通常為 5-10  mg/ml  。 注意： APC  在綴合前作為 SAS  (硫酸銨鈉)

沉淀物最穩定。如果將 APC   以 SAS   沉淀物的形式儲存，則必須在使用前進行大量純化。在用每毫 升 1 升的“透析緩沖液”透析之前，用每毫升1 升 APC   的 PBS   進行透析2 次。

2.使用1 .7毫克APC 修飾每毫克lgG,    包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。

3.檢查 APC  的純度和濃度，請測量280、620和655 nm   處的吸光度。   (1 mg/ml    的 APC  在 655nm   處的 OD  為 5 . 9 ) 。 655/620   比 率 > 1 . 4 表明雜質被充分去除；  655/280    比 率 > 4 表 明所有其他蛋白質均已充分去除

二  .A   PC 的 活 化

1.使用前在無水 DMSO   中制備 10  mg/ml     的 SMCC  儲備溶液。

2.每毫克 APC  加 入 6 μlSMCC,    并進行渦旋。將反應管用鋁箔包好，室溫下旋轉60 分鐘。

3.將純化的 APC  過凝膠過濾柱來交換緩沖液。

注意：對于失敗或效果較差的結合，增加或減少 SMCC   相對于 APC   的量，可能會有所好轉。

三 . 1gG    還 原

1.在蒸餾水中制備 1 M  DTT(15.4       mg/100       μl)  的新鮮溶液。

2.1gG  溶液濃度應為 4 mg/ml   或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進行； MES 、 磷酸鹽和 TRIS    緩沖液 (pH     范圍為 6 至8)已被驗證可以使用。如果抗體濃度低于 2  mg/ml,   則應濃縮。緩沖液交換柱上的損失應額外增加10%。

3.用 DTT  配制 20 mMlgG    溶液：每毫升 IgG   溶液加入 20μ lDTT      原液并攪拌。室溫下靜置30

分鐘，無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。

4.將還原的lgG 通過預平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級分，測定蛋白濃度，并將含

有大部分lgG 的級分匯集在一起?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。

5.此步驟后盡快進行綴合。

注意：對于結合較差或失敗的情況，降低 DTT  濃度可能會有所幫助。

四 .進 行 綴 合

1.每毫克IgG     添加 1 . 5毫克 SMCC-APC 。 用鋁箔包裹反應管并在室溫下旋轉60 分鐘。注意：這 些 摩 爾 比 ( 每 1gG  約 2 個 APC)  效果很好。對于失敗或效果不佳的結合，不同的摩爾比可能會有所 幫助。

2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應的游離巰基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO   中制備 10 mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每 毫 克 |gG  添加 34μ g(3.4μl)       。 室溫下包裹并旋轉20 分鐘。

 2.60 分鐘后，必須去掉 lgG   上未反應的游離巰基。

3.在 1.0 ml  干 DMSO  中制備 10  mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl)      。 室溫下包裹并旋轉20 分鐘。