?彗星法DNA損傷測(cè)試盒說明書
???????????????????????????????????????????????彗星法
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一、測(cè)定原理：
DNA 在自由基（如·OH）的攻擊下容易發(fā)生損傷，即脫氧戊糖遭到破環(huán)，磷酸二脂鍵的斷裂，堿基的破環(huán)或脫落，便可進(jìn)一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂。將細(xì)胞固定于低熔點(diǎn)瓊脂糖中，取少量細(xì)胞涂在載玻片上，用堿高鹽溶液破壞細(xì)胞膜，再用堿溶液使 DNA 分子解旋。將載玻片置于電泳液中，在電場(chǎng)的作用下，DNA 分子向陽極移動(dòng)。如果 DNA 損傷嚴(yán)重， 碎片多，則電泳速度快。未受損傷的 DNA 大分子則由于細(xì)胞膜的阻隔，滯留在原處。用 PI 染色或銀染，可觀察到 DNA 受損的細(xì)胞形同彗星現(xiàn)象，作定性分析。也可用相關(guān)的軟件作定量分析。
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二、試劑盒組份：
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組份 |
20T |
儲(chǔ)存條件 |
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Lysis Bufffer |
100ml |
4℃保存 |
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DMSO |
8ml |
4℃保存 |
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正常熔點(diǎn)瓊脂糖 NMA |
30mg |
4℃保存 |
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低熔點(diǎn)瓊脂糖 LMA |
30mg |
4℃保存 |
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Propidium Iodide （PI） |
400μl |
4℃避光保存 |
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?彗星法DNA損傷測(cè)試盒說明書
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三、所需儀器及自備試劑：
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低速離心機(jī)、水平電泳儀、熒光顯微鏡、37℃和 45℃恒溫水浴箱、載玻片、蓋玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microtube、0.4mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液、PBS
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四、注意事項(xiàng)：Propidium Iodide（PI）和EB有毒，操作時(shí)要戴手套。
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五、操作步驟：
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1、細(xì)胞用冰冷的 PBS 洗一次，離心收集，用 PBS 重懸使其密度為 1×10^6 個(gè)/ml；
2、鋪膠：下述各濃度瓊脂糖凝膠均用 PBS 配制，
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第 1 層凝膠的制備：將載玻片的磨砂面向上，45℃預(yù)熱，將預(yù)熱 45℃的 100μl 的 0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖（NMA）鋪于載玻片上，蓋上干凈的蓋玻片，再置 4℃ 下 10min 使 NMA 凝固。
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第 2 層凝膠的制備：將 10μl 細(xì)胞（約 104 個(gè)）和 75μl 的 0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖 LMA（在 37℃ 下水浴加熱至少 20min 使之完全溶化）混合均勻。然后，輕輕揭去蓋玻片，迅速將含細(xì)胞的 LMA 滴到第 1 層瓊脂糖上，立即蓋上另一干凈蓋玻片，置 4℃10min 使第 2 層 LMA 凝固。
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第 3 層凝膠的制備：第 2 層 LMA 凝固后，在室溫下小心移去蓋玻片，滴加預(yù)熱 37℃的75μl 的 0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖 LMA，如上蓋上蓋玻片 4℃下凝固（第三層覆蓋第二層周圍 0.5mm，增加凝膠化作用時(shí)間至 30min，高濕度環(huán)境）。
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3、細(xì)胞裂解：移去蓋玻片，將玻片置于平皿中，倒入預(yù)冷的 Lysis Bufffer（使用前每 9ml 加入 1ml 的 DMSO），4℃裂解 1～2h，取出載玻片用 PBS 漂洗。
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4、DNA 堿解旋：將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液（用戶自備 1mmol/L EDTA，300mmol/L NaOH），約覆過載玻片膠面 0.25cm 左右，室溫放置 20～ 60min,以便使 DNA 在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段，使 DNA 斷鏈在電場(chǎng)中易于遷移。
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5、單細(xì)胞電泳：在電壓 25V，電泳 20～30min，電壓、電流可用改變緩沖液面高低來調(diào)節(jié)。
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6、中和與染色：電泳后將載玻片置于平皿內(nèi)。加入 0.4mmol/L Tris-HCl（ph7.5）緩沖液，將載玻片沒入，4℃中和三次，每次 10min，棄去 Tris-HCl 緩沖液，每載玻片加 20μl 的 PI 染液或 EB 染液，蓋上蓋玻片，避光染色 10min。
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7、觀察、拍照和分析：熒光顯微鏡 515～560nm 波長(zhǎng)的激發(fā)光、PI 染色的 DNA 圖象呈紅色，EB 染色的DNA 圖象呈桔紅色，可清楚地觀察到核DNA 和遷移的DNA（即慧星尾）。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇100 個(gè)細(xì)胞，測(cè)定核DNA 直徑和DNA遷移的長(zhǎng)度，可并用相應(yīng)的軟件分析。
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DNA 損傷按慧星尾部 DNA 量占全部 DNA 量的比例分為 5 級(jí)：
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0 級(jí)： ???＜ 5% ??????????無損傷；
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1 級(jí)： ??5 ～20% ?????? ??輕度損傷；
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2 級(jí)： ??20～40% ?????????中度損傷；
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3 級(jí)： ??40～95% ?????????高度損傷；
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4 級(jí)： ??＞ 95% ?????????重度損傷。
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