三維（3D）生物打印技術是將生物材料和活細胞組成的生物墨水精確地打印，從而將活細胞封裝成精細的結構，已廣泛應用于各種應用，包括組織工程、藥物篩選和再生醫學。3D生物打印需要使用負載細胞的生物墨水進行可靠、準確的打印，但生物墨水儲存庫中的細胞沉降是導致打印過程不穩定和nozzle堵塞一個重大問題?；趪娔夹g的生物打印雖然具有較高的打印分辨率和生物油墨沉積的良好可控性等優點。但是，它對生物油墨粘度的兼容性有限，只有粘度范圍在3-30mPa·s的低粘度生物墨水較為適用，但打印過程中細胞沉降是顯著的。

▲ 圖1 含活細胞生物墨水噴墨生物打印過程中細胞沉降對打印質量的影響

如圖1所示。在噴墨生物打印過程中，生物墨水儲存庫中的細胞沉積現象及其導致的細胞聚集和打印可靠性差。在生物打印過程開始時，生物墨水使用移液管進行混合，生物墨水儲存庫內的細胞空間分布相對均勻。隨著打印時間的增加，懸浮細胞沉積到生物墨水庫底部，底部局部細胞濃度明顯增加。為了解決這一現象，徐長學課題組提出了一個物理模型進行研究。

▲ 圖2 當選擇低細胞濃度進行3D生物噴墨打印時，在沉降過程中單個細胞的受力分析

理論研究對于了解細胞沉降現象的機理很重要。通過在噴墨生物打印過程中對單個細胞進行力分析，系統地研究了細胞沉降機制，一般來說，細胞的沉降過程由四種力決定，包括重力、阻力、浮力和細胞間相互作用產生的力。當選擇低細胞濃度的生物墨水進行3D生物打印時，細胞彼此相對遠離，細胞間的力交互作用是可以忽略不計的。由于細胞的重力大于細胞的浮力，細胞開始沉淀，阻力開始發揮作用。在穩態平衡狀態下，胞體引力與胞體浮力和阻力相平衡，如圖2所示。隨著打印時間的推移，細胞越來越多地沉積到生物墨水庫底部，導致局部細胞濃度顯著增加。相鄰細胞之間的距離越來越小。當它達到一個臨界值時，細胞-細胞相互作用的力開始發揮作用，細胞開始通過細胞間的相互作用相互粘附形成細胞聚集，從而影響噴墨打印過程及結果。

▲ 圖3 滲透機制導致的水運輸和促進擴散機制導致的離子運輸

但是，胞體重力在胞體沉降過程中可能會發生變化，由于細胞膜具有選擇性的滲透性，存在水的輸運，如圖3所示，水通過滲透作用在細胞膜上進出細胞，直到達到平衡。細胞沉降現象的主要特征是通過測量細胞沉降速度和由此引起的細胞濃度變化來表征。細胞沉降速度以μm/s為單位，具體值取決于不同類型的細胞，其質量和生物墨水的組成不同（如聚合物濃度、生物材料等），研究結果如圖4所示。

▲ 圖4 細胞沉降定量:(a) Ficoll PM400濃度對MCF-7乳腺癌細胞沉降速度的影響;(b)海藻酸鈉濃度和打印時間對生物墨水庫底部細胞沉降速度和由此產生的細胞濃度的影響

Chahal等人利用了含有MCF-7乳腺癌細胞和不同Ficoll濃度的Ficoll PM400的生物墨水。在沒有Ficoll PM400的情況下，平均細胞沉降速度為7.5μm/s，導致嚴重的細胞沉降和細胞聚集成細胞簇。然而，當Ficoll PM400的濃度分別增加到5%、10%和15%（w/v）時，這個平均速度分別下降到2.3、0.8和−0.15μm/s。這表明，在10-15%（w/v）FicollPM400時達到了中性浮力。Xu等人使用含有NIH 3T3小鼠成纖維細胞和海藻酸鈉的生物墨水，系統地定量生物墨水儲存庫底部的細胞沉降速度和最終的細胞濃度。結果表明，當海藻酸鈉濃度從0.5%增加到1.0%（w/v）時，細胞沉降速度從1.45μm/s下降到0.65μm/s。隨著打印時間的延長，生物墨庫底部局部細胞濃度增加。細胞沉降導致細胞粘附和聚集，顯著影響生物打印性能，因此研究者們提出了各種方法來減緩細胞沉降，主要可分為兩類：主動攪拌充滿細胞的生物墨水和添加功能性生物相容性材料。如圖5所示。

▲ 圖5 減緩細胞沉降的方法：（a）在噴墨生物打印中使用磁攪拌棒間歇攪拌；（b）)在噴墨生物打印中使用磁力攪拌裝置；（c）在噴墨生物打印中添加Ficoll PM400以實現中性浮力；（d）在基于微閥的生物打印中添加PVP大分子；（e）在投影式立體平版印刷中添加SF顆粒以增加生物墨水的粘度

結論

首次專門針對3D生物打印中的細胞沉降現象進行綜述，有助于人們更多地關注這一現象及其對打印可靠性和質量的影響。隨著打印時間的推移，懸浮細胞沉積到生物墨水庫的底部，是3D生物打印中的挑戰，直接關系到細胞的粘附和聚集，嚴重影響3D生物打印的打印性能。徐長學課題組提出的基于物理的模型有助于解決細胞沉積過程中的復雜動力學問題。然而除了生物墨水濃度和粘度外，還有其他參數可能影響細胞沉降和聚集，因此，研究新的有效和高效的緩解方法至關重要。細胞沉積是一個涉及材料科學、機械工程和生物醫學工程的多學科課題，應該開發整合這些領域的方法來緩解細胞沉降，以確保打印的可靠性以及使用3D生物打印制造的組織和器官的功能。